4-メチル安息香酸のラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 4-Methylbenzoic acid in Rats

要約

4-メチル安息香酸は，染料，顔料，塗料，衛生材料や中間物質を含む農薬，金属防錆や防蝕剤といった各種添加物等に用いられている芳香族炭化水素である1)．その毒性についてはマウスおよびラットを用いた急性毒性試験が実施されているが，毒性に関する情報は乏しい．今回，4-メチル安息香酸の安全性確認のための資料を得ることを目的としてラットにおける28日間反復経口投与毒性試験(回復14日間)を，雌雄のSprague-Dawley系ラットを用いて実施した．雌雄とも4群構成とし，1群には媒体である0.5 %カルメロースナトリウム水溶液を，他の3群には被験物質を，それぞれ100，300および1000 mg/kgの用量で28日間反復強制経口投与した．試験には雌雄とも各群5匹ならびに回復試験用に対照群および1000 mg/kg投与群各5匹を加えた計60匹の動物を使用した．

死亡例はなく，投与期間中，1000 mg/kg投与群において，投与第16日から雄1例，雌2例に投与直後に一過性の流涎が認められた．また，1000 mg/kg投与群の雌では投与第8日から摂餌量の増加が認められた．投与期間終了時の検査では，1000 mg/kg投与群の雌で血小板数の減少傾向とAST(GOT)活性の上昇がみられた．その他には，一般状態および詳細な臨床観察，および各種臨床検査ならびに病理組織検査で被験物質投与によると思われる変化は認められなかった．

以上の結果，本試験条件下における4-メチル安息香酸の無作用量は，雌雄とも300 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質および投与検体の調製法

被験物質は，東レ(東京)より提供された4-メチル安息香酸(ロット番号10206，純度98.85 %)を入手後，試験開始まで室温で保管し，使用した．被験物質の安定性は，受領前および返却後(試験終了後)に提供元で被験物質の品質試験を実施することにより確認した．

検体調製では，各濃度に相当する被験物質を乳鉢で粉砕後，媒体を加えてミキサー(あわとり練太郎，シンキー)で撹拌し，所定濃度の懸濁液を調製した．媒体には，注射用水(光製薬)を溶媒として0.5 %に調製したカルメロースナトリウム(丸石製薬)水溶液を使用した．

投与検体は，冷蔵条件下で8日間の安定性が確認されているので1週間に1回の頻度で調製し，使用時まで冷蔵庫にて保管した．また，投与検体中に含まれる被験物質の含量および均一性は，秦野研究所において確認した．

2.　使用動物および飼育方法

試験には，4週齢で購入し，検疫と飼育環境への馴化を兼ねて8日間予備飼育した雌雄のSprague-Dawley系[Crj:CD(SD)IGS，SPF]ラット(日本チャールス・リバー)各30匹を使用した．

群分けは，投与開始日前日の体重に基づいて体重別層化無作為抽出法により行った．各群の動物数は，雌雄とも対照群および高用量群を各10匹とし，低および中用量群を各5匹とした．

動物は，温度21.0〜25.0 ℃，湿度40.0〜75.0 %，換気回数約15回/時および照明12時間(7時〜19時点灯)に設定された飼育室内で，金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(CE-2，日本クレア)と水道水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した．

3.　投与量の設定および投与方法

本試験の投与量は，先に実施した予備試験の結果を基に決定した．即ち，4-メチル安息香酸を0，40，200および1000 mg/kgの用量で雌雄動物に7日間反復経口投与した結果，投与第3日に200 mg/kg投与群の1例で投与直後に一過性の軟便が認められた以外は，各群とも一般状態，体重および剖検に変化は認められなかったことから，本試験の投与用量は1000 mg/kgを高用量とし，以下，公比約3で除して300および100 mg/kgを中および低用量に設定した．

投与経路は経口とし，1日1回，28日間，ラット用胃管を用いて強制的に投与した．投与容量は 5 mL/kgとし，雌雄とも最近時の体重をもとに個体別に投与液量(mL)を算出した．なお，回復期間は14日間とした．

4.　観察および検査

1)　一般状態

毎日(投与期間中は投与前および投与約2〜3時間後)，全例の生死を含む一般状態の観察を行った．

2)　詳細な臨床観察

スコアリング法による詳細な臨床観察を，投与前および投与開始後は回復期間終了日まで1週間に1回，ブラインドで行った．観察は，ケージ越しで，姿勢・体位，自発運動，発声，振戦，痙攣について観察し，ハンドリング時では，取り出し易さ，扱い易さ，心拍動，体温，被毛，皮膚色，可視粘膜，流涙，眼球突出，瞳孔径，流涎について観察し，さらに作業台上の観察で，姿勢・体位，探索行動，身づくろい，発声，挙尾反応，歩行，常同行動，奇妙な行動，振戦，痙攣，呼吸数，立毛，眼裂，排尿回数，排便回数，接触に対する反応，撤去反応，耳介反射を観察した．また，投与第4週には，刺激に対する反応性の観察として，聴覚刺激に対する反応では驚愕反応，視覚刺激に対する反応では視覚定位，瞳孔反射，固有感覚刺激に対する反応では正向反射を合わせて実施した．

3)　体重および摂餌量

体重は，投与第1週には3回，その後は毎週2回の頻度で測定したほか，投与期間終了日，回復試験期間終了日および剖検日にも測定した．摂餌量は毎週1回の頻度で測定した．

4)　尿検査

投与第4週および回復期間第2週に全例を代謝ケージに収容して蓄尿し，約4および24時間の時点で採尿した．この4時間尿を用いて試験紙法(クリニテック200+，バイエル・三共)によりpH，潜血，蛋白，糖，ケトン体，ウロビリノーゲンおよびビリルビンの定性試験を行い，光学顕微鏡により沈渣を，視診により色調および混濁度を検査した．さらに，24時間尿の重量を天秤測定し，1 mLの重量から得られた比重で除して24時間における尿量を算出した．

5)　剖検

剖検は，投与期間ないし回復期間終了日から翌日の剖検日にかけて18から24時間絶食させた後，ペントバルビタールナトリウムで麻酔し，腹部後大静脈から，血液学検査用としてクエン酸ナトリウムおよびEDTA-2 Kを抗凝固剤として採血し，次いで，血液生化学検査用として抗凝固剤にヘパリンを用いて採血した．採血は，対照群，低，中および高用量群の順序で，1匹ずつ動物番号の若い方から選択して行った．

6)　血液学検査

血液自動分析装置(CELL-DYN3500SL，ダイナボット)を用いて，電気抵抗法により赤血球数，平均赤血球容積，血小板数を測定し，白血球数はフローサイトメトリー・レーザー光散乱法/電気抵抗法で，白血球分類はフローサイトメトリー・レーザー光散乱法で，血色素量は吸光度法により測定し，これらを基にヘマトクリット値，平均赤血球血色素量および平均赤血球血色素濃度を算出した．また，全自動血液凝固測定装置(CA-1000，東亜医用電子)を用いて，プロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間を光散乱検出法により測定した．

7)　血液生化学検査

遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA，ロシュ)を用いて総蛋白濃度はビウレット法で，アルブミン濃度はBCG法で，総コレステロール濃度はCOD・DAOS法で，ブトウ糖濃度はヘキソキナーゼG6PDH法で，尿素窒素濃度(BUN)はウレアーゼGl.DH法で，クレアチニン濃度はJaff法で，ALP活性はGSCC法で，AST(GOT)活性はIFCC法で，ALT(GPT)活性はIFCC 法で，γ-GTP活性はIFCC法で，トリグリセライド濃度はGPO・HAOS法，グリセリン消去法で，総ビリルビン濃度はアゾビリルビン変法で，無機リン濃度はモリブデン酸直接法で，カルシウム濃度はOCPC法で測定し，A/G比を算出した．また，全自動電解質分析装置(EA05，A&T)により，ナトリウム濃度，カリウム濃度および塩素濃度を電極法により測定した．

8)　病理学検査

採血終了後，必要に応じて腋窩動脈を切断して放血屠殺した後，器官および組織を肉眼的に観察した．また，各動物の脳，胸腺，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，精巣，副腎，精巣上体の重量を測定し，各器官重量を剖検日の体重で除してそれぞれの相対重量を算出した．次いで，脳，脊髄，心臓，肺(気管支を含む)，気管，肝臓，腎臓，脾臓，胃，小腸(回腸，パイエル板を含む)，大腸(結腸)，前立腺，精嚢，卵巣，子宮，腟，膀胱，甲状腺，副腎，大腿骨および骨髄，腸間膜リンパ節，下顎リンパ節，胸腺，坐骨神経を0.1Mリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に，精巣，精巣上体をブアン液に浸漬固定した．固定後，対照群および高用量群の標本は，パラフィン包埋して薄切し，ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し，光学顕微鏡を用いて組織学的に検査した．

5.　統計解析

体重，摂餌量，半定量検査を除く尿検査ならびに血液学検査，生化学検査の値および器官重量については，群ごとに平均値および標準偏差を求めた．また，3群以上の被験物質投与群について対照群と比較する場合は，Bartlettの方法による分散の一様性の検定の後，一元配置型の分散分析あるいはKruskal-Wallisの順位検定を行い，Dunnett型の検定法で多重比較を行った．2群間で比較する場合には，F-検定を行い，Studentのt検定法あるいはAspin-Welchのt検定法を用いて有意差検定を行った．その他，尿の半定量的検査成績については，m×nの分割表を用いるχ2検定を行い，Dunnett型の検定法により多重比較を行った．病理組織学検査所見のグレード分けしたデータについては，Mann-WhitneyのU検定(両側検定)を行い，陽性グレードの合計値はFisherの直接確率片側検定を行った．なお，いずれの検定も有意水準を5 %とした．

結果

1.　死亡例

投与期間および回復試験期間中に死亡例はなかった．

2.　一般状態

投与第2日から第3日の間に，軟便が1000 mg/kg投与群の雄で3例，雌で2例に一時的に認められたが，それ以後は認められなかったため，被験物質の影響によるものか不明であった．また，投与直後に一過性の流涎が1000 mg/kg投与群の雄1例，雌2例に投与第16日から認められ始めた．ただし，投与第27日は認められなかった．その他には，投与期間および回復試験期間中にいずれの群にも一般状態の変化は認められなかった．

3.　詳細な臨床観察

試験期間中に週一回行ったスコアリング法による観察では，ケージ越しからの観察で，投与期間中および回復試験期間中に雌雄各群に変化はなかった．ハンドリング時では，取り出し易さおよび扱い易さの観察で，試験期間中に動物の取り扱い時に発声がみられたが，対照群と各被験物質投与群に差は認められなかった．作業台上の観察時では，排尿および排便回数で投与期間中に対照群と各被験物質投与群の間で雌雄に明らかな差はなかったが，回復試験期間中に雄の1000 mg/kg投与群で排尿した動物の数が対照群より多かった．しかし，投与期間中の成績に差がなかったことから被験物質による変化ではないと考えた．接触に対する反応では，投与第4週に雄の1000 mg/kg 投与群でやや過敏に反応する動物が多かった．しかし，雌では対照群と各被験物質投与群との間に差はなかったことから，被験物質投与による影響ではないと判断した．

投与第4週に行った刺激に対する反応性の観察では，いずれの観察項目にも差は認められなかった．

4.　体重(Fig. 1，2)

投与期間中および回復期間中，雌雄共に被験物質投与群と対照群との間で体重推移に差は認められなかった．

5.　摂餌量(Fig. 3)

1000 mg/kg投与群の雌において，投与第8日に摂餌量の有意な増加がみられ，これ以後，投与期間中に増加傾向がみられた．雄では投与期間中，摂餌量に差は認められなかった．

回復期間中では，雌雄ともに摂餌量に有意な差は認められなかった．

6.　尿検査(Table 1)

投与第4週の検査で1000 mg/kg投与群の雌雄に尿量の有意な増加が認められ，これに伴うと考えられる尿比重の有意な低下が雄にみられた．同様に300 mg/kg投与群の雄でも尿量の有意な増加と尿比重の低下がみられた．一方，被験物質投与群では，対照群に比べ給水ビン中の水の量が少ないことから，摂水量の増加が窺えた．また，1000および100 mg/kg投与群の雌雄に尿の pHの低下が見られた．その他，雄の1000および300 mg/kg投与群の尿蛋白と1000 mg/kg投与群のケトン体が有意差に減少した．

回復期間終了週の検査では，被験物質投与群と対照群との間に明らかな変化はなかった．沈渣には投与期間終了週および回復期間終了週の検査で被験物質投与群と対照群との間に明らかな変化はなかった．

7.　血液学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査では，1000 mg/kg投与群の雌の血小板数に減少傾向がみられた．雄では好酸球比率が有意に減少したが，生理的変動の範囲内であった．また，プロトロンビン時間の短縮傾向がみられたが用量依存的な変化ではなく，雌では認められなかったことから，偶発的な変化と判断した．なお，1000 mg/kg投与群の雌1例については，サンプルに凝固が認められたので，血液凝固時間以外の測定結果は採用しなかった．

回復期間終了時の検査では，1000 mg/kg投与群の雄において赤血球数，血色素量およびヘマトクリット値の有意な低下が認められたが，生理的変動の範囲内であり，被験物質投与による影響ではなかった．

8.　血液生化学検査(Table 3)

投与期間終了時の検査では，1000 mg/kg投与群の雌で総蛋白濃度の減少とAST(GOT)活性の上昇に有意差が認められた．

回復期間終了時の検査では，対照群と比較して雌雄いずれにおいても有意な差は認められなかった．

この他の検査項目には，対照群と被験物質投与群の間に有意差は認められなかった．

9.　病理学検査

1)　器官重量(Table 4)

投与期間終了時および回復期間終了時の剖検では，いずれの器官重量にも変化は認められなかった．

2)　剖検所見

投与期間終了時屠殺例では，対照群および各被験物質投与群のいずれの器官にも変化は観察されなかった．

回復期間終了時屠殺例では，1000 mg/kg投与群の雌で1例に脾臓の腫大が認められたほかに，異常所見は認められなかった．

3)　組織学検査(Table 5)

投与期間終了時屠殺例では，以下に示す変化が観察された．

肝臓では，1000 mg/kg投与群および対照群の雌雄全例に門脈周囲性の脂肪化が観察され，1000 mg/kg投与群では対照群よりやや程度の強い雄1例，雌3例がみられたが，脂肪化の程度は軽度であり，有意な差は認められなかった．その他，雌の1000 mg/kg投与群の2例および対照群の1例，雄の1000 mg/kg投与群の1例に小肉芽腫がみられた．

腎臓では，雌の1000 mg/kg投与群の2例および対照群の4例，雄の1000 mg/kg投与群の2例および対照群の1例で好塩基性尿細管が観察されたが，程度はいずれの例もごく軽度であった．また，雄の対照群の1例に好酸性小体が認められたほか，鉱質沈着が雄の1000 mg/kg 投与群の髄質および雌の対照群の皮髄境界部に各1例みられた．

脾臓では，1000 mg/kg投与群および対照群で雌雄全例に髄外造血，雌全例に褐色色素の沈着がみられたが，それぞれ両群間に程度の差は認められなかった．

その他の病理組織検査を実施した器官に異常所見は認められなかった．

回復期間終了時屠殺例では，剖検時，1000 mg/kg投与群の雌1例に認められた腫大した脾臓では，中等度の髄外造血像と軽度の褐色色素の沈着が観察された．

考察

4-メチル安息香酸を100，300および1000 mg/kgの用量で雌雄のSprague-Dawley系ラットに28日間反復経口投与した結果，一般状態の変化として，1000 mg/kg投与群の雌雄に流涎が認められた．また，雌では摂餌量の増加傾向が認められた．同様の変化は本被験物質の簡易生殖毒性試験において1000 mg/kg投与群の動物にも認められていることから，被験物質投与による影響と考えられる2)．流涎や摂餌量の増加は，刺激性を有する物質を経口投与した際にしばしば認められるため，4-メチル安息香酸のこれらの変化は被験物質投与に起因した変化であると考えられる．

1000 mg/kg投与群の雌において血小板数の減少傾向と AST(GOT)活性の上昇が認められた．類似した変化は，本被験物質の類似物質である3-メチル安息香酸を用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験の300 mg/kg以上の用量で認められていることから被験物質投与に起因した変化であると考えられる3)．一方，同じく類似物質である4-ヒドロキシ安息香酸を用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験において300 mg/kg以上の用量において認められた，体重増加抑制とAST(GOT)，ALT(GPT)活性の低下は本試験では認められなかった4)．

以上のように4-メチル安息香酸の28日間反復投与によって引き起こされた毒性作用は軽度ではあったが，1000 mg/kg投与によって雌雄に流涎が認められ，雌において摂餌量が増加し，血小板数が減少傾向を示し， AST(GOT)活性が上昇した．従って以上の成績より，4-メチル安息香酸の28日間反復経口投与毒性試験における無作用量は雌雄の300 mg/kg/dayと考えられた．

文献

1)化学物質データベース．Kis-NET，番号1139，国立環境研究所(2003).
2)代田眞理子 ら：4-メチル安息香酸のラットを用いる経口投与簡易生殖毒性試験．化学物質毒性試験報告，11：216-228(2004)．
3)山本　譲ら：3-メチル安息香酸のラットを用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験．化学物質毒性試験報告，7：302-313(1999)．
4)長尾哲二ら：4-ヒドロキシ安息香酸のラットを用いる反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験．化学物質毒性試験報告，5：251-262(1997)．

連絡先
試験責任者：関　剛幸
試験担当者：加藤博康
（財）食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Takayuki Seki(Study Director)
Hiroyasu Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627