4-(1-メチルプロピル)フェノールの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
4-(1-Methylpropyl)phenol on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

　OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，4-(1-メチルプロピル)フェノールの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響を評価するため，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU，以下CHLと略す) を用いて試験管内染色体異常試験を実施した．

　染色体異常試験に用いる濃度を決定するため，細胞増殖抑制試験を行ったところ，直接法48時間処理における約50％ の増殖抑制を示す濃度は 0.049 mg/ml であった．また，代謝活性化法の S9mix 存在下および非存在下における約50％ の増殖抑制を示す濃度は，それぞれ 0.067 mg/ml および 0.040 mg/ml であった．従って染色体異常試験において，直接法では 0.049 mg/ml，代謝活性化法の S9mix 存在下では 0.067 mg/mlの処理濃度をそれぞれ高濃度とし，それぞれその 1/2 の濃度を中濃度，1/4 の濃度を低濃度として設定した．また，代謝活性化法の S9mix 非存在下では，約50％ の増殖抑制濃度が直接法における濃度に近い値であることから， 0.049 mg/mlの濃度を高濃度とした．

　直接法により，CHL 細胞を24時間処理したすべての処理群において，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．しかしながら，48時間処理した最高処理濃度の 0.049 mg/ml では，観察した細胞の5.5％に染色体異常が認められた．一方，代謝活性化法においては，S9mix 非存在下における処理群では，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかったが， S9mix 存在下では，中濃度（0.034 mg/ml）の処理群で観察した細胞の7％に染色体異常が認められた．これらの結果より，直接法の48時間処理群と代謝活性化法のS9mix 存在下群について， in vitro 小核試験による追加試験を実施したところ，再現性は認められなかった．

　以上の結果より4-(1-メチルプロピル)フェノールは，上記の試験条件下で，試験管内の CHL 細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．

方法

1．使用した細胞

　リサーチ・リソースバンク（JCRB）から入手（1988年2月，入手時：継代 4代）したチャイニーズ・ハムスター由来の CHL 細胞を，解凍後継代 10代以内で試験に用いた．

2．培養液の調製

　培養には，牛胎児血清（FCS：JRH BIOSCIENCES，ロット番号：1C2073）を 10％ 添加したイーグル MEM 培養液を用いた．

3．培養条件

　2×10^4 個の CHL 細胞を，培養液 5 ml を入れたディッシュ (径 6 cm，Corning) に播き，37℃のCO2 インキュベーター (5％ CO2 ) 内で培養した．

　直接法では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，代謝活性化法では，細胞播種3日目にS9mixの存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4．被験物質

　4-(1-メチルプロピル)フェノール（CAS No.：99-71-8，ロット番号：C-119，大日本インキ化学工業(株)製造，(社)日本化学工業協会提供）は淡黄色固体で，水に難溶，ジメチルスルホキシド (DMSO) およびアセトンに易溶である．分子式C10H14O，分子量150.24，融点53℃，沸点242℃，蒸気圧135.4〜136.5℃/mmHgの物質で，純度は66％である．原体は熱，光，酸素等に対して安定であり，溶媒中(DMSO) での安定性試験では，0.06〜15 mg/ml の濃度範囲で3時間は安定であった．

5．被験物質の調製

　被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒はDMSO（Sigma Chemical Co.，ロット番号：30H0608）を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 0.5％ (v/v) になるように加えた．染色体異常試験および小核試験の直接法および代謝活性化法に用いた高濃度群と低濃度群の調製液の濃度は，すべて許容範囲内（平均含量が添加量の 85％ 以上）の値であった．なお，濃度については，純度換算は行わなかった．

6．細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

　染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計（Monocellater，オリンパス光学工業(株)）を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

　その結果，4-(1-メチルプロピル)フェノールの約50％ の増殖抑制を示す濃度を，50％をはさむ2濃度の値より算出したところ， 直接法では 0.049 mg/ml であった．また，代謝活性化法の S9mix 存在下および非存在下における約50％ の増殖抑制を示す濃度は，それぞれ 0.067 mg/ml および 0.040 mg/ml であった (Fig. 1，2)．

7．実験群の設定

　細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，直接法では 0.049 mg/ml，代謝活性化法の S9mix 存在下では 0.067 mg/ml とし，それぞれ高濃度群の 1/2 の濃度を中濃度，1/4 の濃度を低濃度とした．なお，代謝活性化法の S9mix 非存在下においては，約50％ の増殖抑制を示す濃度が，直接法におけるその濃度に近い値であったことから，直接法と同様に 0.049 mg/mlの濃度をを高濃度とし，その 1/2 の濃度を中濃度，1/4 の濃度を低濃度とした．

　In vitro 小核試験による追加試験では，直接法，S9mix 存在下における代謝活性化法ともに最高処理濃度を0.049 mg/mlとし，公比を1.5とする4つの処理群を設定した．

8．染色体標本作製法

　培養終了の 2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1 μg/ml になるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各シャーレにつき6枚作製した．作製した標本を，3％ギムザ溶液で約 10分間染色した．

9．染色体分析

　作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，複数の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験（MMS）分科会1）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞（polyploid）の有無について観察した．また構造異常については 1群 200個，倍数性細胞については 1群 800個の分裂中期細胞を分析した．

10．小核標本作製法

　培養終了後，ディッシュより細胞を剥離し，遠心して得られた細胞を 0.15 M KCl 水溶液で約20分間低張処理した．メタノ−ル：氷酢酸（5：1）の固定液で細胞を固定後スライド上に1滴滴下し，スライド標本を作製した．作製した標本を，3％ギムザ溶液で約 10分間染色した．

11．小核標本の観察

　作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，二人の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．観察は，60倍以上の対物レンズ( 接眼10倍 ) をつけた顕微鏡を用いて行った．細胞質を含み，細胞質周辺の明瞭な間期細胞1000個について観察し，小核（直径が主核の1/3以下であり，色調により明らかに核由来と判定できるもの2））をもった細胞を算定した．

12．記録と判定

　無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．染色体異常を有する細胞の出現頻度について，フィッシャーの exact probability test 法により，溶媒対照群と被験物質処理群間および溶媒対照群と陽性対照群の有意差検定を行った．被験物質の染色体異常誘発性については，石館ら3) の判定基準に従い，染色体異常を有する細胞の頻度が 5％ 未満を陰性，5％ 以上 10％ 未満を疑陽性，10％ 以上を陽性としたが，疑陽性の結果が得られた場合，in vitro 小核試験を実施し再現性を確認して最終判定を行うこととした．in vitro 小核試験に関しては，Kastenbaum and Bowman の方法4）（1970）に従って有意差検定（p＜0.05）を行い，小核誘発の判定を行った．

結果および考察

　直接法による染色体分析の結果を Table 1 に示した．4-(1-メチルプロピル)フェノールを加えて 24時間処理したいずれの群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の出現頻度に有意な増加は認められなかった．また， 48時間処理した中濃度群および低濃度群でも，染色体の構造異常および倍数性細胞の出現頻度に有意な増加は認められなかった．しかしながら，最高処理濃度群（0.049mg/ml）では，観察した細胞の5.5％に染色体異常が認められた．

　代謝活性化法による染色体分析の結果を Table 2 に示した．4-(1-メチルプロピル)フェノールを加えて S9mix 存在下および非存在下で 6時間処理した最高処理濃度群では，分裂抑制のため染色体分析ができなかった．その他の処理群では，S9mix 非存在下において染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．しかし， S9mix 存在下では，中濃度（0.034 mg/ml）の処理群で，観察した細胞の7％に染色体異常が認められた．

　以上の結果より，疑陽性の結果が得られた直接法48時間処理と代謝活性化法 S9 mix 存在下群については，再現性を確認するため in vitro 小核試験を追加試験として実施した（Table 3）．その結果，いずれの処理群においても小核の誘発は見られず，染色体異常誘発性に関して再現性が得られなかった．

　従って，今回実施した試験条件下では4-(1-メチルプロピル)フェノールの染色体異常誘発性はないものと判断した．

文献

1）日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，“化学物質による染色体異常アトラス，”朝倉書店，1988．
2）日本組織培養学会編，“細胞トキシコロジ−試験法，”P.247-251，朝倉書店，1991．
3）石館　基　監修，“〈改訂〉染色体異常試験データ集，”エル・アイ・シー社，1987．
4）Kastenbaum M. A. and K. O. Bowman，Mutat. Res.，9，527-549，1970．

連絡先
試験責任者:田中憲穂
試験担当者:山影康次，佐々木澄志，若栗　忍，日下部博一，橋本恵子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka ( Study director )
Kohji Yamakage，
Kiyoshi Sasaki，
Shinobu Wakuri，
Hirokazu Kusakabe，
Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute，Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai，Hadano，Kanagawa，257，Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627