検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537 1)および Escherichia coli WP2 uvrA 2,3)の5菌株を用い，S9 mix 無添加および添加試験のいずれも，用量設定試験で抗菌性が認められなかったことから，本試験では S9 mix 無添加試験および添加試験を 313〜5000 μg/プレートの範囲で実施した．ただし，S9 mix 添加試験については，本試験Iで各検定菌とも変異コロニー数が増加し，低用量でプラトー値に近い値を示したため，本試験IIでは，用量範囲を 31.3〜500 μg/プレートに下げて実施した．
その結果，S9 mix 無添加試験では TA100, TA98 および TA1537 において，S9 mix添加試験ではすべての検定菌において，溶媒対照値の2倍以上となる再現性のある復帰変異コロニー数の増加が認められた．
以上の結果から，4-ニトロ-o-アニシジンは，用いた試験系において変異原性を有する(陽性)と判定された．
E. coli WP2 uvrA 株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．
検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異(rfa)とアンピシリン耐性因子 pKM101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
| AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株)) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
下記の水溶液(A)および(B)を容量比 10:1 の割合で混合した．
| (A) | バクトアガー(Difco) | 0.6％ |
| 塩化ナトリウム | 0.5％ | |
| (B)* | L-ヒスチジン | 0.5 mM |
| D-ビオチン | 0.5 mM |
| *: | WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた． |
2) 合成培地
培地は，極東製薬工業(株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 l あたりの組成は下記のとおりである．
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| バクトアガー(Difco) | 15 g |
3) S9 mix
1 ml中下記の成分を含む
| S9** | 0.1 ml |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| **: | 7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix 添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液 0.1 ml を混合し，37℃で20分間往復振とう培養したのち，トップアガー2 mlを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した．溶媒および陽性対照群は，同時に実施した他の試験と共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性の確認を行った．また，陽性結果が得られた検定菌に関しては，本試験で変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上となった用量について，変異コロニー数の平均値から溶媒対照値を差し引いた値を用量で除して比変異活性値(誘発復帰変異コロニー数/mg)を求めた．
したがって，本試験における最高用量は，S9 mix 無添加試験および添加試験とも5000 μg/プレートとした．
その結果，S9 mix 無添加試験では TA100, TA98 および TA1537 において，S9 mix添加試験ではすべての検定菌において溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加が認められ，用量依存性もみられた．
すべての検定菌で S9 mix 添加試験の方が無添加試験より変異コロニー数が高かったことから，当被験物質は代謝により変異原性が強まるものと考えられる．当被験物質の最大比変異活性値は，TA100 の S9 mix 添加試験における 20608 誘発復帰変異コロニー/mg(本試験II，62.5 μg/プレート)で，同一条件下における陽性対照物質2-アミノアントラセンの値(693000 誘発復帰変異コロニー/mg)の約30分の1であった．
以上の結果に基づき，4-ニトロ-o-アニシジンは，用いた試験系において変異原性を有する(陽性)と判定した．
| 1) | D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F.J. de Serres, J. Ashby, Elsevier/North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360. |
| 3) | M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187. |
| 4) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K.H. Norpoth, R.C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 原 巧，坂本京子，堀谷尚古，川上久美子 | ||
| (財)食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
| 〒257 秦野市落合 729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
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| Authors: | Tohru Shibuya(Study Director) Takumi Hara, Kyoko Sakamoto,Naoko Horiya, Kumiko Kawakami, | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan | ||||
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