1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 1,3-Bis(2-methylphenyl)guanidine in Bacteria

要約

1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの遺伝子突然変異誘発性の有無を検討するため，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537および Escherichia coli WP2 uvrA を用い，S9 mix 非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．

用量は，菌の生育阻害が認められた用量を最高用量とし，直接法においてはTA100およびTA1537で78.1～2500 μg/plate，TA98，TA1535およびWP2 uvrAでは156～5000 μg/plateの範囲(公比2)，また，代謝活性化法ではいずれの菌株とも156～5000 μg/plateの範囲(公比2)で設定した．

試験を2回行った結果，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．菌の生育阻害については，直接法ではTA1537の1250 μg/plate以上，TA100の2500 μg/plate並びにTA98，TA1535およびWP2 uvrAの2500 μg/plate以上の用量で，また，代謝活性化法ではいずれの菌株とも2500 μg/plate以上の用量で認められた．

以上の成績から，1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの細菌に対する遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．

方法

1．指標菌株

国立公衆衛生院地域環境衛生学部から1994年12月19日に分与を受けた S. typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537¹⁾および E. coli WP2 uvrA²⁾の5菌株を用いた．各菌株は，超低温槽で－80℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その25 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated，Difco Laboratories)液体培地 15 mL に接種し，37℃で12時間振盪培養した．培養後の懸濁菌液は濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より 1 mL あたり 1×10⁹ 以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．

各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

2．被験物質

1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジン(ロット番号30J08，住友化学工業(東京)提供)は，白色粉末で，水に不溶，アセトンに5.7 g/100 mL(20℃)，エタノールに3.7 g/100 mL(20℃)，メタノールに5.9 g/100 mL(20℃)可溶であり，純度99.6 %の物質である．被験物質は，冷暗所(4℃)で密栓保管した．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

3．被験物質供試液の調製

被験物質は水に不溶であり，予備的検討の結果，ジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶であったことから，溶媒にはDMSO(和光純薬工業)を用い，被験物質を溶解して最高用量の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定用量の供試液を調製した．供試液は，用時調製した．

4．陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを使用した．

AF-2	:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業)
2-AA	:	2-アミノアントラセン(和光純薬工業)
NaN₃	:	アジ化ナトリウム(和光純薬工業)
9-AA	:	9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical)

AF-2 および 2-AA はDMSOに，NaN₃ および 9-AA は蒸留水(大塚製薬工場)に溶解した．

5．培地

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．

硫酸マグネシウム・七水塩	0.2 g
クエン酸・一水塩	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20 g
寒天(OXOID Agar No.1)	15 g

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6 w/v%寒天粉末(Difco Laboratories)および0.5 w/v%塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S.typhimurium用には0.5 mmol/L D-ビオチンおよび0.5 mmol/L L-ヒスチジン水溶液，E.coli 用には0.5 mmol/L L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

6．S9 mix

エームステスト用凍結S9 mix(キッコーマン)を購入し，製造後6ヶ月以内に使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与した Sprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

7．試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

試験管に使用溶媒0.1 mL，被験物質供試液0.1 mLあるいは陽性対照物質溶液0.1 mLを入れ，次いで直接法では 0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL ，代謝活性化法では S9 mix を0.5 mL 加え，続いて試験菌液 0.1 mL を分注し，37℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，用量設定試験では各用量とも1枚，本試験では3枚を使用した．本試験は，同一用量を用いて2回行った．

8．結果の判定

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数(平均値)が溶媒対照値の2倍以上を示し，用量依存性および結果の再現性が認められる場合を陽性とした．

但し，明確な用量依存性が認められない場合においても，陽性値を示す試験結果に再現性が認められれば陽性と判定することとした．

結果および考察

20～5000 μg/plate の範囲で行った用量設定試験において，直接法の場合は，TA100およびTA1537では2000 μg/plate以上，TA98，TA1535およびWP2 uvrAでは5000 μg/plateの用量で，また，代謝活性化法の場合は，いずれの菌株とも5000 μg/plateの用量で菌の生育阻害が認められた．したがって，本試験における被験物質の用量は，直接法の場合は，TA100およびTA1537では2500 μg/plateを最高用量とし，以下公比2で1250，625，313，156および78.1 μg/plate，TA98，TA1535およびWP2uvrAでは5000 μg/plateを最高用量とし，以下公比2で2500，1250，625，313および156 μg/plateのそれぞれ計6用量，また，代謝活性法の場合は，いずれの菌株とも5000 μg/plateを最高用量とし，以下公比2で2500，125，625，313および156 μg/plateの計6用量とした．

試験を2回行った結果(Table 1～4)，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株において復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えることはなかった．菌の生育阻害については，直接法では，TA1537の1250 μg/plate以上，TA100の2500 μg/plate並びにTA98，TA1535およびWP2uvrAの2500 μg/plate以上の用量で，また，代謝活性化法においては，いずれの菌株とも2500 μg/plate以上の用量で認められた．

以上の成績から，本実験条件下では，1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．

1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの変異原性については，S. typhimurium を用いた復帰突然変異試験において，陰性であったとの報告があるが，指標菌株に対して毒性が認められるほどの高用量を用いた試験結果ではないので，false negative の可能性もある³⁾と報告されている．これに対して，指標菌株に対し毒性の認められる用量を用いて行った今回の試験によって，陰性結果が確認されたものと考える．

1,3-ビス(2-メチルフェニル)グアニジンの類縁化合物の変異原性について，1,3-ジフェニルグアニジンは，S. typhimuriumを用いた復帰突然変異試験で陰性³⁾，S. typhimuriumおよびEscherichia coliを用いた復帰突然変異試験で陰性⁴⁾，CHL/IU細胞を用いた染色体異常試験で陰性⁵⁾と報告されている．

文献

1)	Maron DM, Ames BN:Revised methods for the Salmonella mutugenitiy test. Mutation Research, 113:173-215(1983)．
2)	Green MHL:“Handbook of Mutagenicity Test Procedures”, Vol.3, Kilbey BJ, Legator M, Nichols W, Ramel C(eds.), Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford(1984)pp. 161-187．
3)	Rannug A, Rannug U, Ramel C:Genotoxic effects of additives in synthetic elastomers with special consideration to the mechanism of action of thiurames and dithiocarbamates. In “Industrial Hazards of Plastics and Synthetic Elastomers”, Alan R. Liss, Inc., New York(1984) pp. 407-419.
4)	榎本佳明，清水優子，大久保智子:1,3-ジフェニルグアニジンの細菌を用いる復帰変異試験．化学物質毒性試験報告，8:418-422(2001)．
5)	中川宗洋，大田絵津奈，石毛裕子，成見香瑞範:1,3-ジフェニルグアニジンのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験．化学物質毒性試験報告，8:423-425(2001)．

連絡先

試験責任者：野田　篤

試験担当者：野田　篤，昆　尚美

（財）畜産生物科学安全研究所

〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11

Tel 042-762-2775 Fax 042-762-7979

Correspondence

Authors: Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon

Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology 3-7-11

Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132 Japan

Tel +81-42-762-2775 Fax +81-42-762-7979

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