2,4-ジ-tert-ブチルフェノールのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる
染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of 2,4-Di-tert-butylphenol
on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

2,4-ジ-tert-ブチルフェノールの染色体異常誘発性の有無を検討するため，チャイニーズ・ハムスター肺由来の線維芽細胞株(CHL/IU)を用いてin vitroにおける短時間処理法による染色体異常試験を実施した．

染色体異常試験に用いる用量を決定するため，細胞増殖抑制試験を行った結果，S9 mix非存在下では60 μg/mL以上，S9 mix存在下では10 μg/mLの用量で50 %を上回る細胞増殖抑制が認められた．したがって，染色体異常試験における用量は，S9 mix非存在下では10，20，30，40，50および60 μg/mL，S9 mix存在下では1.25，2.5，5，7.5および10 μg/mLとした．

試験の結果，S9 mix非存在下では，染色体異常を有する細胞の増加は認められなかった．50 μg/mL以上では細胞に対する毒性のため観察可能な分裂中期像は認められなかった．一方，S9 mix存在下では用量依存的な染色体構造異常細胞の増加が認められ，7.5および10 μg/mLでの増加(出現頻度12.5および22.0 %)は統計学的に有意なものであった．

以上の成績から，2,4-ジ-tert-ブチルフェノールは，CHL/IU細胞に対し染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

方法

1.　試験細胞株

国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部(元:国立衛生試験所変異原性部)から昭和60年1月13日に分与を受けたチャイニーズ・ハムスター肺由来の線維芽細胞株(CHL/IU)を使用した．供試細胞は，浮遊細胞液に10 vol%の割合でジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業(株))を添加し，液体窒素条件下で保存したものを培養液に戻し，解凍後の継代数が4回までのものを使用した．

2.　培養液

Eagle-MEM粉末培地(Gibco Laboratories)を常法に従い調製し，これに非働化仔牛血清(Gibco Laboratories)を10 vol%の割合で添加したものを用いた．

3.　培養条件

4 × 103個/mLの細胞を含む培養液5 mLをディッシュ(径6 cm, Becton Dickinson Co.)に加え，37 ℃のCO2インキュベーター(5 % CO2)内で培養した．

培養開始3日後にS9 mix非存在および存在下で被験物質を6時間処理し，処理終了後，新鮮培養液でさらに18時間培養した．

4.　S9 mix

染色体異常試験用凍結S9 mix(キッコーマン(株))を購入し，製造後6ヶ月以内に使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

5.　被験物質

2,4-ジ-tert-ブチルフェノール(ロット番号L874，大日本インキ化学工業(株)(東京)提供)は，淡黄褐色固体で，水に0.1%可溶，DMSO，アセトンおよびアルコールに易溶であり，純度99.67 %(不純物として，ρ-tert-ブチルフェノール0.07 %，2,6-ジ-tert-ブチルフェノール0.04 %，2,4,6-トリ-tert-ブチルフェノール0.03 %，その他のアルキルフェノール類0.19 %を含む)の物質である．被験物質は，冷暗所(4℃)で密栓(窒素充填)保管した．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質供試液の調製

溶媒にDMSO(和光純薬工業(株))を用い，被験物質を溶解して最高用量の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定用量の供試液を調製した．供試液は，用時調製し，そのディッシュ内への添加量は培養液量の0.5 vol%とした．

7.　細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理用量を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた． 0.1 w/v%クリスタルバイオレット水溶液で染色した細胞の密度を単層培養細胞密度計(モノセレーター，MI-60，オリンパス光学工業(株))を用いて測定し，溶媒対照群の細胞増殖率を100 %とした時の各用量群の細胞増殖率を求めた．

その結果(Fig. 1, 2)，S9 mix非存在下では60 μg/mL以上，S9 mix存在下では10 μg/mLの用量で50 %を上回る細胞増殖抑制が認められ，50 %細胞増殖抑制用量は，それぞれ40〜60 μg/mLおよび5〜10 μg/mLの用量域にあるものと判断された．

8.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果から，染色体異常試験における被験物質の用量は，50 %細胞増殖抑制用量の前後が含まれ，かつ3用量以上のデータが得られることを考慮して，S9 mix非存在下では10，20，30，40，50および60 μg/mLの6用量，S9 mix存在下では1.25，2.5，5，7.5 および10 μg/mLの5用量を設定した．対照として，溶媒対照群と陽性対照群を設けた．

陽性対照として，短時間処理法S9 mix存在下では3,4-benzo[a]pyrene(B[a]P, Sigma Chemical Co.)を10 μg/mL，S9 mix非存在下では1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine(MNNG, Aldrich Chemical Co.)を2.5 μg/mLの用量で用いた．陽性対照物質の溶媒には，いずれもDMSO(和光純薬工業(株))を使用した．

9.　染色体標本の作製

培養終了2時間前にコルセミド(Gibco Laboratories)を最終濃度として0.2 μg/mLとなるように添加した．トリプシン処理で細胞を剥離し，遠心分離により細胞を回収した．75 mM塩化カリウム水溶液で低張処理後，用時調製した冷却メタノール・酢酸(3:1)混合液で細胞を固定した．空気乾燥法で染色体標本を作製した後，1.4 vol%ギムザ液で約15分間染色した．

10.　染色体の観察

各ディッシュあたり100個，すなわち，1用量当たり2ディッシュ，200個の分裂中期像を，総合倍率600倍の顕微鏡下で観察した．標本は全てコード化し，盲検法で観察を行った．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会(MMS)による分類法1)に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型の切断，交換などの構造異常と倍数性細胞(Polyploid)の有無について観察した．

11.　記録と判定

観察した細胞数，構造異常の種類と数および倍数性細胞の数について集計し，記録した．

染色体構造異常細胞および倍数性細胞の出現頻度について，多試料x2検定を行い有意差(有意水準5 %以下)が認められた場合は，フィッシャーの直接確率法を用いて溶媒対照群と各用量群との間の有意差検定(有意水準は多重性を考慮して，5 %または1 %を処理群の数で割ったものを用いた)を行った．

その結果，溶媒対照群と比較して，被験物質による染色体異常細胞の出現頻度が2用量以上で有意に増加し，かつ用量依存性あるいは再現性が認められた場合，陽性と判定した．

結果および考察

短時間処理法による結果をTable 1に示す．S9 mix非存在下では，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．50 μg/mL以上では，被験物質の細胞に対する毒性のため，観察可能な分裂中期像が認められなかった．一方，S9 mix存在下においては，用量依存的な染色体の構造異常を有する細胞の増加が認められ，7.5および10 μg/mLでの増加(出現頻度12.5および22.0 %)は溶媒対照群と比較して統計学的に有意なものであった．倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

以上の成績から，2,4-ジ-tert-ブチルフェノールは，その代謝物に染色体構造異常を誘発する作用があると考えられた．したがって，本実験条件下では，2,4-ジ-tert-ブチルフェノールのCHL/IU細胞に対する染色体異常誘発性は陽性と判定した．陽性結果が得られたため，D20値2) (分裂中期像の20 %に異常を誘発させる被験物質の推定用量)を算出したところ，本被験物質のD20値は，短時間処理法S9 mix存在下において0.011 mg/mLであった．本試験結果は，CHL/IU細胞において，染色体異常を有する細胞の出現頻度が10 %以上を陽性とする石館らの判定基準3)からみても，明らかに陽性と判断されるものであった．

2,4-ジ-tert-ブチルフェノールの類縁化合物である2-tert-ブチルフェノール4)，4-tert-ブチルフェノール5)および2-sec-ブチルフェノール6)はCHL/IU細胞を用いた染色体異常試験でいずれも陽性，4-sec-ブチルフェノールは同様の試験で構造異常誘発に関し疑陽性7)の結果が報告されている．2,6-ジ-tert-ブチルフェノールおよび4-tert-ブチルフェノールについては，ラット肝細胞を用いた染色体異常試験ではともに陰性8)と報告されている．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，“化学物質による染色体異常アトラス，”朝倉書店，東京，1988, pp.16-37.
2)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室 監修，“化審法毒性試験法の解説 改訂版，”化学工業日報社，東京，1992, pp.51-52.
3)石館基監修，“改定増補 染色体異常試験 データ集，” エル・アイ・シー，東京，1987, p.19．
4)野田篤，昆尚美，化学物質毒性試験報告，8, 224(2001)．
5)田中憲穂，山影康次，中川ゆずき，日下部博一，橋本恵子，水谷正寛，古畑紀久子，化学物質毒性試験報告，4, 301(1996)．
6)野田篤，昆尚美，化学物質毒性試験報告，7, 232(1999)．
7)田中憲穂，山影康次，佐々木澄志，若栗忍，日下部博一，橋本恵子，化学物質毒性試験報告，2, 347(1995)．
8)B. J. Dean, T. M. Brooks, G. Hadson-Walker, D. H. Hutson, Mutat. Res., 153, 57(1985).

連絡先
試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132 Japan
Tel +81-42-762-2775Fax +81-42-762-7979