4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)の
細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 4,4-Thiobis(6-tert-butyl-m-cresol)on Bacteria

要約

既存化学物質安全性調査事業の一環として，4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)について，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し，陰性の結果を得た．

検定菌として， Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により，用量設定試験を50～5000 μg/プレートの用量で行ったところ，S9 mix無添加試験および添加試験のいずれにおいてもSalmonellaの4検定菌において強い抗菌性が認められたが，WP2 uvrAでは抗菌性は認められなかった．

したがって，本試験では S9 mix無添加試験をTA100, TA1535およびTA1537は0.781～50 μg/プレート， TA98は3.13～200 μg/プレート，WP2 uvrAは313～5000 μg/プレートの範囲で，S9 mix添加試験をS. typhimuriumの4菌株は12.5～800 μg/プレート，WP2 uvrAは313～5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して実施した

その結果， S9 mix無添加試験では，TA100およびTA1537は，12.5 μg/プレート，TA1535は25 μg/プレート，TA98は100 μg/プレートで抗菌性が認められたが，WP2 uvrA では認められなかった．またS9 mix添加試験ではTA100，TA1535，およびTA1537は400 μg/プレート，TA98は800 μg/プレートで抗菌性が認められたが，WP2 uvrAでは認められなかった．復帰変異コロニー数は，2回の本試験とも，用いた検定菌について，いずれの用量においても復帰変異コロニー数の増加は認められなかったことから，4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)は，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は -80℃以下で凍結保存したものを用い，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)(CAS No. 96-69-5)は，分子量358.54の白色結晶性粉末である．試験には，住友化学工業(株)製〔ロット番号:40701，純度 98％以上(不純物:不明)〕のものを，6日本化学工業協会から供与され，使用時まで室温保管し，用いた．

4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)は，ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解性がよいことから，DMSOに50 mg/mlになるように溶解した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．

試験の開始に先立って， 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)のDMSO溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した．安定性試験においては，本試験Ⅱで調製した低濃度(7.81 μg/ml)溶液および高濃度(50.0 mg/ml)溶液について，室温遮光条件下で，安定性を調べた．その結果，調製4時間後における各濃度の平均含量は，それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して，100および98.6％であった．

また，含量測定試験を行った結果，調製液の濃度は，高濃度は 94.7％，低濃度は98.3％であった．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2	:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド	(上野製薬(株))
SA	:	アジ化ナトリウム	(和光純薬工業(株))
9AA	:	9-アミノアクリジン	(Sigma Chem. Co.)
2AA	:	2-アミノアントラセン	(和光純薬工業(株))

AF2, 2AAはDMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSO に，SA は純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

(A)	バクトアガー(Difco)	0.6％
	塩化ナトリウム	0.5％
(B)	* L-ヒスチジン	0.5 mM
	D-ビオチン	0.5 mM

*:	WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2 g
クエン酸・1水和物	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20 g
バクトアガー(Difco)	15 g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む

S9**	0.1 ml
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
グルコース-6-リン酸	5 μmol
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol

**: 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレート法により， S9 mix 無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 ml)，検定菌液 0.1 mlおよびトップアガー2 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)について50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施したところ，S9 mix無添加試験では，TA100, TA1535およびTA1537はすべての用量で，TA98は150 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められたが，WP2 uvrAでは抗菌性は認められなかった．また，S9 mix添加試験ではS. typhimuriumの4菌株はすべて500 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められたが，WP2 uvrA では抗菌性は認められなかった．

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1, 2に示した．4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)の用量を，S9 mix無添加試験ではTA100, TA1535およびTA1537は0.781～50 μg/プレート，TA98は3.13～200 μg/プレート，WP2 uvrA は313～5000 μg/プレートの範囲で，S9 mix添加試験ではS. typhimuriumの4菌株は12.5～800 μg/プレート， WP2 uvrAは313～5000 μg/プレートの範囲で公比を2として試験を実施した．その結果，2回の試験のいずれも，用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき， 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m- クレゾール)は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)	D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：原　　巧，坂本京子，川上久美子，清水ゆり，松木容彦，中込まどか，中尾美津男，飯田さやか

(財)食品薬品安全センター　秦野研究所

〒257　秦野市落合729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara,
Kyoko Sakamoto,
Kumiko Kawakami,
Yuri Shimizu,
Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi,
Mitsuo Nakao,
Sayaka Iida
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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