4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)のラットを
用いる 28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
4,4'-Thiobis(6-tert-butyl-m-cresol) in Rats

要約

既存化学物質の毒性評価の一環として， 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)の0(5%アラビアゴム水溶液)，15，60，および250 mg/kgをSD系ラットに28日間強制経口投与し，その毒性を検討した．0，60および250 mg/kg群については，別に14日間の回復群を設けた．

被験物質投与に起因する一般状態の変化はみられず，体重への影響もみられなかった．

摂餌量では，投与開始初期に一時的な減少が 250 mg/kg群の雌雄でみられたが，雄ではその後対照群をやや上回って推移した．60 mg/kg群の雄の摂餌量も対照群をやや上回って推移した．尿検査では，pHの低下が60 mg/kg群の雌と250 mg/kg群の雌雄に，尿蛋白およびケトン体の増加が60および250 mg/kg群の雌に，血液学検査では，血小板数の増加が250 mg/kg群の雌雄に，分葉核好中球比率の増加およびリンパ球比率の減少が250 mg/kg群の雌に，血液生化学検査では，無機リンの増加が60 mg/kg以上の投与群の雌に，総コレステロールの増加が250 mg/kg群の雌雄に，リン脂質および尿素窒素の増加と血糖値の低下が250 mg/kg群の雌にみられた．

病理学検査では， 250 mg/kg群の雌雄に肝臓重量の増加，肉眼的な小腸壁の肥厚と盲腸の拡張がみられた．組織学的には，肝臓で小葉中心帯肝細胞の肥大と回腸における腸絨毛の過形成が250 mg/kg群の雌雄に，盲腸と結腸で吸収上皮細胞の空胞化が60 mg/kg以上の投与群の雌雄に，また，盲腸粘膜の細胞浸潤が60 mg/kg以上の投与群の雌雄に，結腸粘膜の細胞浸潤が60 mg/kg以上の投与群の雌にみられた．さらに，腸間膜リンパ節では，傍皮質領域における“tingible body macrophage”が250 mg/kg群の雌に多くみられた．回復群においては，回腸以外のほとんどの変化は消失した．

以上の結果から，本試験条件下における 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)の無影響量は雌雄とも15 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質および被験液の調製

被験物質 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)は，分子量358.54，融点160〜165℃，水に不溶，アセトンおよびメタノールに可溶の白色結晶性粉末である．本試験にはロット番号40701(住友化学工業(株)製)，純度98%以上のものを用いた．なお，投与終了後の残余被験物質について分析を行った結果，使用期間中は安定であったことが確認された．

投与容量が 5 ml/kg体重となるよう，5%アラビアゴム水溶液に懸濁して0.3，1.2および5%(w/v)懸濁液を調製した．0.1〜5%(w/v)懸濁液は，室温で1日間および冷蔵(約4℃)・暗所(褐色ガラス瓶)で8日間まで安定であったことから，最大1週間分を一括して調製し，1日分ずつ褐色ガラス瓶に分注して冷蔵庫(約4℃)に保存した．また，投与開始前および投与終了週の2回，投与に使用する各濃度液について当施設で測定した結果，いずれも濃度は適正でかつ均一であった．

2.　使用動物および飼育条件

5週齡のCrj:CD(SD)系SPF雌雄ラットを日本チャールス・リバー(株)から購入し，当所で約1週間検疫・馴化飼育した後，体重増加が順調で一般状態に異常を認めなかった雌雄各42匹を選び，6週齡で試験に供した．投与開始日の体重範囲は，雄で193〜222 g(平均値：208.0 g)，雌で148〜171 g(平均値：157.4 g)であった．

動物は，群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群平均体重がほぼ均等となるよう，コンピュータを用いて各群に割り付けた．

動物は，温度 23±3℃，相対湿度50±20%，換気回数1時間当たり11〜13回，照明1日12時間の飼育室で，金属製網ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(放射線滅菌CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))および飲料水(水道水)を自由に摂取させ飼育した．

3.　投与量および投与方法

2週間投与による予備試験(投与量：0，5，60，250および1000 mg/kg)の結果，1000 mg/kg群で多数例が死亡し，250 mg/kg群ではGOTおよびGPTの上昇，血糖値の低下，盲腸の拡張などがみられた．一方，60 mg/kg以下の投与群では変化はみられなかった．これらの成績から，本試験では250，60および15 mg/kgの3用量を設定し，これに対照群を加えて計4群を使用した．さらに，対照群，60および250 mg/kg群では回復群を設けた．動物数はいずれの群も雌雄各6匹とした．

被験液の投与容量は 5 ml/kg体重とし，金属製胃ゾンデを用いて1日1回28日間強制経口投与した．対照群には溶媒(5%アラビアゴム水溶液)を同様に投与した．投与液量は最新の体重を基準に算出した．回復期間は14日間とした．

4.　検査項目

1)　一般状態の観察

投与期間中は毎日 2回以上，回復期間中は毎日1回観察した．

2)　体重

投与期間および回復期間を通じ，週 2回の頻度で体重を測定した．

3)　摂餌量測定

投与期間および回復期間を通じ，週 2回の頻度で摂餌量を測定した．

4)　血液学検査

投与期間および回復期間終了の翌日の剖検時に検査を行った．前日から一夜 (約16時間)絶食させた動物をエーテル麻酔下で開腹し，腹大動脈から抗凝固剤(EDTA-2K)を加えた採血ビンに血液を採取し，赤血球数(電気抵抗変化検出法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(平均赤血球容積および赤血球数から算出)，平均赤血球容積(電気抵抗変化検出法)，平均赤血球血色素量(ヘモグロビン量および赤血球数から算出)，平均赤血球血色素濃度(ヘモグロビン量およびヘマトクリット値から算出)，血小板数(電気抵抗変化検出法)，白血球数(電気抵抗変化検出法)(以上コールター全自動8項目血球アナライザーT890，(株)日科機)，網赤血球率(Brecher法)および白血球百分率(May-Giemsa鏡検法)を測定した．また，3.8%クエン酸ナトリウムを加えた容器に採取した血液を遠心分離(3000 rpm，10分間)し，得られた血漿を用いてプロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間(以上クロット法，血液凝固自動測定装置，ACL-100，Instrumentation Laboratory)を測定した．

5)　血液生化学検査

血液学検査のための採血と同時に腹大動脈から採血し，遠心分離 (3000 rpm，10分間)により得られた血清を用いてAlP(Bessey-Lowry法)，総コレステロール(CEH-COD-POD法)，トリグリセライド(GK-GPO-POD法)，リン脂質(PLD-ChOD-POD法)，総ビリルビン(アゾビリルビン法)，血糖(Hexokinase-G6PD法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaff法)，ナトリウム，カリウムおよび塩素(イオン選択電極法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(モリブデン酸法)，総蛋白質(Biuret法)，アルブミン(BCG法)およびA/G比(総蛋白質およびアルブミンから算出)を測定した．また，ヘパリンを加えた容器に採血し，遠心分離(3000 rpm，10分間)により得られた血漿を用いてGOT，GPT，LDH(UV-rate法)，γ-GTP(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド法)およびChE(DTNB法)(以上いずれも自動分析装置Monarch，Instrumentation Laboratory)を測定した．

6)　尿検査

投与終了時剖検動物は投与第 4週(検査当日の投与後)に，回復群の動物は回復第2週に検査を行った．検査動物を代謝ケージに個別に収容し，絶食・自由摂水下で4時間尿を，次いで自由摂食・自由摂水下でその後の20時間尿を採取した．採取した最初の4時間尿を用いてpH，蛋白質，ケトン体，ブドウ糖，潜血，ビリルビン，ウロビリノーゲン(以上URIFLET7A試験紙，(株)京都第一科学)，色調(肉眼観察)および沈渣(鏡検)を検査した．また，その後に得られた20時間尿を用いて比重(屈折法，アタゴ屈折計，(株)アタゴ)を測定し，4時間尿量および20時間尿量から1日の尿量を算出した．さらに，代謝ケージに収容した状態で，前日からの1日の摂水量を給水瓶を用いて測定した．

7)　剖検および器官重量

上記血液学検査および血液生化学検査のための採血後に放血致死させ，外表異常の有無を観察した後，頭部，胸部および腹部を含む全身の器官・組織について肉眼的に異常の有無を観察した．続いて，以下に示す器官を摘出後，器官重量 (絶対重量)を測定した．また，絶食後の体重および絶対重量から体重100 g当たりの相対重量を算出した．

脳，胸腺，心臓，肺 (気管支を含む)，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，卵巣

8)　病理組織学検査

全動物について以下に示す全器官・組織を採取し，リン酸緩衝 10%ホルマリン液(但し，眼球およびハーダー腺は3%グルタルアルデヒド・2.5%ホルマリン液)で固定した．さらに，*印を施した器官・組織についてパラフィンに包埋した．投与終了時剖検動物では，このうち対照群と高用量群は包埋した全ての器官・組織について，また，中および低用量群は被験物質投与による変化が疑われた小腸(十二指腸〜回腸)，大腸(盲腸〜直腸)，肝臓および腸間膜リンパ節についてそれぞれ切片とし，ヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色を施して鏡検した．回復群では，被験物質投与による変化が疑われた上記の腸管，肝臓および腸間膜リンパ節について全動物を検査した．

脳 *，脊髄*，坐骨神経*，胸大動脈，心臓*，気管*，肺(気管支を含む)*，舌，食道，胃*，十二指腸*，空腸*，回腸*，盲腸*，結腸*，直腸*，唾液腺(顎下腺・舌下腺)，肝臓*，膵臓*，下垂体*，甲状腺(上皮小体を含む)*，副腎*，胸腺*，脾臓*，腸間膜リンパ節*，頸部リンパ節*，腎臓*，膀胱*，精巣*，精巣上体*，精嚢，前立腺*，卵巣*，子宮*，腟*，乳腺，皮膚，眼球*，ハーダー腺，骨及び骨髄(胸骨・大腿骨)*，大腿筋，肉眼的異常部位*

5.　統計解析

各検査項目のうち，数値化した成績についてまず Bartlett法により各群の分散の均一性の検定を行った．その結果，分散が均一の場合には一元配置法による分散分析を行い，群間に有意差が認められたならば，Dunnett法(各群の例数が等しいとき)またはScheff法(各群の例数が異なるとき)を用いて対照群と各投与群との平均値の差の検定を行った．分散が均一でない場合には，Kruskal-Wallisの順位検定を行い，有意であればDunnett型(各群の例数が等しいとき)またはScheff型(各群の例数が異なるとき)を用いて対照群と各投与群との平均順位の差の検定を行った．検定はいずれも両側で，有意水準は5および1%とした1)．

結果

1.　一般状態

死亡はみられず，いずれの動物にも異常はみられなかった．

2.　体重(Fig.1)

1)　投与期間

雌雄ともに，各投与群の体重は対照群と同様に推移した．

2)　回復期間

雌雄ともに，各投与群の体重は対照群と同様に推移した．

3.　摂餌量

1)　投与期間

雄では， 250 mg/kg群で投与4日に対照群を有意に下回った．しかし，その後は対照群をやや上回って推移し，有意差もみられた．また，60 mg/kg群でも対照群をやや上回って推移し，有意差もみられた．雌では，250 mg/kg群で投与4日に対照群を有意に下回った．しかし，その後は対照群と同様に推移した．

2)　回復期間

雌雄ともに，各投与群の摂餌量は対照群と同様に推移した．

4.　血液学検査(Table 1)

1)　投与終了時

雄では， 250 mg/kg群で血小板数の有意な増加がみられた．他に，プロトロンビン時間の有意な短縮が60 mg/kg群にみられたが，用量に関連した変化ではなかった．雌では，250 mg/kg群で血小板数および分葉核好中球比率の有意な増加とリンパ球比率の有意な減少がみられた．

2)　回復終了時

雌雄ともに， 250 mg/kg群で血小板数の有意な増加がみられた．

5.　血液生化学検査(Table 2)

1)　投与終了時

雄では， 250 mg/kg群で総コレステロールの有意な増加がみられた．雌では，60 mg/kg以上の投与群で無機リンの有意な増加がみられたほか，250 mg/kg群で総コレステロール，リン脂質および尿素窒素の有意な増加と血糖値の有意な低下がみられた．

2)　回復終了時

雄では，血糖の有意な低下が 250 mg/kg群でみられた．雌では，総コレステロールとリン脂質の有意な増加が60 mg/kg群でみられたが，用量に関連した変化ではなかった．

6.　尿検査(Table 3)

1)　投与第４週

雄では， 250 mg/kg群に尿pHの低下傾向と尿沈渣中のリン酸塩の増加傾向がみられた．雌では，60 mg/kg以上の投与群で尿pHの低下傾向，尿蛋白，ケトン体および尿沈渣中のリン酸塩の増加傾向がみられた．

2)　回復第2週

雄では， 250 mg/kg群に尿蛋白の増加傾向がみられた．雌では，250 mg/kg群で尿pHの低下傾向がみられた．

7.　器官重量(Table 4)

1)　投与終了時剖検例

肝臓で，相対重量の有意な増加が 250 mg/kg群の雌雄にみられた．

2)　回復終了時剖検例

心臓で，相対重量の有意な増加が雄の各投与群にみられた．

他に，脳の絶対重量の有意な増加が雌の 60 mg/kg群にみられたが，用量と関連した変化ではなかった．

8.　剖検所見(Table 5)

1)　投与終了時剖検例

盲腸の拡張が 250 mg/kg群の雄5例と雌4例に，小腸壁の肥厚が250 mg/kg群の雌雄各4例にみられた．他には被験物質投与によると考えられる変化はみられなかった．

2)　回復終了時剖検例

被験物質投与によると考えられる変化はみられなかった．

9.　病理組織学検査(Table 6)

1)　投与終了時剖検例

被験物質投与によると考えられる変化が小腸，大腸，肝臓および腸間膜リンパ節にみられた．

回腸：腸絨毛のごく軽度な過形成が 250 mg/kg群の雄1例と雌3例にみられた．本所見は，腸絨毛の丈の高さの増大として観察され，組織構築の変化あるいは炎症反応は認められなかった．

盲腸：吸収上皮細胞のごく軽度から軽度な空胞化が 60 mg/kg群の雄3例と雌1例，250 mg/kg群の雌雄各5例にみられた．また，粘膜におけるごく軽度から軽度な細胞浸潤が60 mg/kg群の雄5例と雌1例，250 mg/kg群の雌雄各3例にみられたが，吸収上皮細胞の空胞化を示す個体と細胞浸潤を示す個体とは必ずしも一致していなかった．

結腸：吸収上皮細胞のごく軽度な空胞化が 60 mg/kg群の雌雄各1例，250 mg/kg群の雄1例と雌2例にみられた．また，粘膜におけるごく軽度な細胞浸潤が雌の60および250 mg/kg群でそれぞれ1および2例にみられた．

直腸：粘膜におけるごく軽度な細胞浸潤が 250 mg/kg群の雌雄各1例にみられた．

肝臓：小葉中心帯肝細胞のごく軽度な肥大が 250 mg/kg群の雌雄各5例にみられた．

腸間膜リンパ節：傍皮質領域において，核崩壊物を容れたマクロファージ“ tingible body macrophage”の出現が，対照群で雄1例(ごく軽度)，15 mg/kg群で雌雄各1例(いずれもごく軽度)，60 mg/kg群で雄1例と雌2例(いずれもごく軽度)にみられたのに対し，250 mg/kg群では雄で2例(1例がごく軽度，残る1例が軽度)と雌で5例(4例がごく軽度，残る1例が軽度)にみられ，250 mg/kg群の雌で例数がやや多かった．

上記以外の所見は出現状況とその病理学的性状からいずれも偶発所見と判断した．

2)　回復終了時剖検例

回腸：腸絨毛のごく軽度から軽度な過形成が， 250 mg/kg群の雌雄各2例にみられた．

盲腸：吸収上皮細胞の変化は認められなかった．なお，粘膜におけるごく軽度から軽度な細胞浸潤が対照群で雌雄各 2例，60 mg/kg群で雄2例と雌1例，250 mg/kg群で雄3例と雌4例にみられた．

直腸：粘膜におけるごく軽度な細胞浸潤が 60 mg/kg群の雌1例，250 mg/kg群の雄1例にみられた．

肝臓：肝細胞の肥大は認められなかった．なお，ごく軽度な微小肉芽腫が対照群の雌雄各 1例，250 mg/kg群の雄1例にみられた．

十二指腸，空腸，結腸および腸間膜リンパ節には異常所見は認められなかった．

考察

試験期間を通じて死亡はみられず，また，一般状態および体重にも被験物質投与による変化は認められなかった．

摂餌量では， 250 mg/kg群の雌雄で投与開始4日に減少を示したが，雄ではその後対照群をやや上回った．60 mg/kg群でも雄の摂餌量は対照群をやや上回った．これらの投与群の体重は，対照群とほぼ同様であったことから，食餌効率は低下しているものと考えられ，後述の腸管に対する障害がその要因と推察される．

尿検査では， 60 mg/kg以上の投与群で尿pHの低下，尿蛋白およびケトン体の増加が主として雌にみられた．同時に，血液生化学検査において，雌で尿素窒素や無機リンの増加がみられたことから，尿蛋白の増加は本被験物質の腎臓に対する影響と考えられるが，腎臓では組織学的変化は認められなかった．また，250 mg/kg群の雌の血糖値は低下していたことから，尿中ケトン体の増加は，血糖値の低下に伴い，エネルギー源としての脂質要求が増大したためと推察される．

血液学検査では，血小板数の増加，リンパ球比率の減少と分葉核好中球比率の増加が 250 mg/kg群の主として雌にみられた．250 mg/kg群の雌におけるリンパ球および分葉核好中球の実数を，白血球数とその分画比率から求めると，リンパ球数は対照群平均値の約20%増，分葉核好中球数は対照群平均値の約160%増であったことから，本試験における白血球分画比率の変化は，分葉核好中球の実質的な増加に起因し，大腸粘膜での細胞浸潤との関連性が示唆される．

血液生化学検査では，既に述べた血糖，尿素窒素および無機リンの変動のほか，総コレステロールとリン脂質の増加が 250 mg/kg群にみられ，脂質代謝への影響も示唆された．

病理学検査では，小腸，大腸，腸間膜リンパ節および肝臓に変化がみられた．小腸では，肉眼的な壁の肥厚が 250 mg/kg群にみられ，組織学的には，回腸で腸絨毛の過形成がみられた．既に述べた如く，60 mg/kg以上の投与群では食餌効率の低下が示唆されたが，小腸における形態学的変化は，消化・吸収能の低下に対する適応的な生体反応と考えられる．また，大腸では，肉眼的な盲腸の拡張が250 mg/kg群にみられ，組織学的には盲腸および結腸で吸収上皮細胞の空胞化および粘膜の細胞浸潤が60 mg/kg以上の投与群にみられ，大腸に対する障害性が示唆された．ただし，吸収上皮細胞の変化を示す個体と細胞浸潤を示す個体とは必ずしも一致せず，両者の関連性は明らかでなかった．腸間膜リンパ節では，傍皮質領域における“tingible body macrophage”が250 mg/kg群にやや多くみられた．この変化は，頸部リンパ節や胸腺，脾臓など他のリンパ器官では認められなかったことから，腸管障害と関連した所見であり，リンパ系器官に対する直接的な作用ではないと考えられる．なお，投与終了時剖検例のうち，250 mg/kg群の雌雄各1例に，直腸粘膜の細胞浸潤がみられたが発現例数が少なく，また，この種の動物では背景的に観察されることから，被験物質投与との関連性はないと判断された．

肝臓では， 250 mg/kg群で重量が増加し，組織学的には小葉中心帯肝細胞の肥大が認められた．血液生化学検査では，GOTやGPTの上昇など肝機能障害を示す所見はみられなかったことから，肝臓の組織所見は，薬物代謝酵素の誘導を示唆するもの2)と推察される．

回復群においては，被験物質投与に関連すると考えられる変化のうち， 250 mg/kg群の尿pHの低下，尿蛋白の増加，血小板数の増加および回腸における腸絨毛の過形成を除く所見は認められず，概ね可逆性の変化と考えられた．

以上の如く， 4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)をラットに28日間反復投与した結果，主な変化が60 mg/kg以上の投与群の大腸に，さらに250 mg/kg群では小腸および肝臓にみられ，本被験物質の主な標的器官は腸管と肝臓と考えられた．一方，15 mg/kg群では変化は認められなかった．これらの結果から，本試験条件下における4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)の無影響量は雌雄とも15 mg/kg/dayと考えられた．

文献

1)S. C. Gad and C. S. Weil, "Principles and Methods of Toxicology," 2, ed. by A. Wallace Hayes, Raven Press, Ltd., New York, 1989, pp. 435-483.
2)J. R. Glaister. "毒性病理学の基礎," 高橋道人監訳, ソフトサイエンス社, 東京, 1992, pp.85-98.

連絡先
試験責任者：岡崎修三
試験担当者：榎並倫宣，中村英明，畠山和久，田村一利，沼田弘明，勝亦倶慶
(株)ボゾリサーチセンター　御殿場研究所
〒412　静岡県御殿場市かまど1284
Tel. 0550-82-2000Fax. 0550-82-2379

連絡先
Authors:Shuzo Okazaki(Study director)
Tomonori Enami,
Hideaki Nakamura,
Kazuhisa Hatayama,
Kazutoshi Tamura,
Hiroaki Numata,
Tomoyoshi Katsumata
Gotemba Laboratory, Bozo Research Center Inc.
1284, Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412, Japan
Tel.+81-550-82-2000Fax.+81-550-82-2379