検定菌として, Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い,S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により,用量設定試験を50~5000 μg/プレートの用量で実施したところ,いずれの検定菌においても,抗菌性は認められなかった.したがって,本試験ではS9 mix 無添加試験および添加試験を313~5000μg/プレートの範囲で用量を設定して実施した.
その結果,復帰変異コロニー数は, 2回の本試験とも,用いたすべての検定菌において,いずれの用量においても,増加は認められなかったことから,エチルメチルケトキシムは,用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された.
S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた.
E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた.
検定菌は -80℃以下で凍結保存したものを用い,試験に際して,ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.
エチルメチルケトキシムは,アセトンに溶解性がよいことから,アセトンに 50 mg/mlになるように溶解した後,同溶媒で公比約3ないし2で希釈し,速やかに試験に用いた.
試験の開始に先立って,エチルメチルケトキシムのアセトン溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した.安定性試験においては,低濃度 (3.13 mg/ml)溶液は本試験Ⅱで調製したものについて,高濃度(174 mg/ml)溶液は,染色体異常試験で調製したものについて,室温遮光条件下で調べた.その結果,における各濃度の平均含量は,それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して,99.4および101%であった.また,含量測定を行った結果,調製液の濃度は,低濃度は93.0%,高濃度は99.2%であった.
AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド | (上野製薬(株)) |
SA | : | アジ化ナトリウム | (和光純薬工業(株)) |
9AA | : | 9-アミノアクリジン | (Sigma Chem. Co.) |
2AA | : | 2-アミノアントラセン | (和光純薬工業(株)) |
(A) | バクトアガー(Difco) | 0.6% |
塩化ナトリウム | 0.5% | |
(B) | * L-ヒスチジン | 0.5 mM |
D-ビオチン | 0.5 mM |
*: | WP2 uvrA 用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた. |
硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
クエン酸・1水和物 | 2 g |
リン酸水素二カリウム | 10 g |
リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
水酸化ナトリウム | 0.66 g |
グルコース | 20 g |
バクトアガー(Difco) | 15 g |
S9** | 0.1 ml |
塩化マグネシウム | 8 μmol |
塩化カリウム | 33 μmol |
グルコースー6-リン酸 | 5 μmol |
NADH | 4 μmol |
NADPH | 4 μmol |
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
**: | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた. |
小試験管中に,被験物質調製液 0.1 ml,リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 ml),検定菌液0.1 mlおよびトップアガー2 mlを混合したのち 合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.培養は37℃で48時間行い,生じた変異コロニー数を算定した.抗菌性の有無については,肉眼的あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌膜の状態から判断した.
用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は同一用量について2回実施し,結果の再現性の確認を行った
1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983). |
2) | M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
連絡先 | |||
試験責任者: | 澁谷 徹 | ||
試験担当者: | 原 巧,坂本京子,川上久美子,清水ゆり,松木容彦,中込まどか,阿部昌弘,飯田さやか | ||
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
〒257 秦野市落合729-5 | |||
Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 |
Correspondence | |||
Authors: | Tohru Shibuya (Study Director) Takumi Hara, Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami, Yuri Shimizu, Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi, Masahiro Abe, and Sayaka Iida | ||
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | |||
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan | |||
Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 |