2-クロロフェノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 2-Chlorophenol in Rats

要約

2-クロロフェノールは，染料中間体，農薬原料である1)．本被験物質は刺激作用があり，皮膚からの吸収も大きく，皮膚に付着すると灼熱感を与える2)．今回，2-クロロフェノールを0，8，40，200および1000 mg/kgの用量で雌雄のSD系ラットに28日間反復経口投与し，その毒性と回復性を検討した．

一般状態において，投与期間中に振戦，自発運動の低下，歩行異常，腹臥位あるいは側臥位が1000 mg/kg群の雌雄に，流涎が200および1000 mg/kg群の雌雄に認められた．投与期間終了時に，血液生化学検査において，無機リンの低値が1000 mg/kg群の雄，トリグリセライドの高値が1000 mg/kg群の雌に認められた．器官重量において，肝臓絶対・相対重量の高値が1000 mg/kg群の雌に認められた．剖検において，肝臓の褐色化が1000 mg/kg群の雌雄に認められた．病理組織学検査において，小葉中心性の肝細胞肥大が1000 mg/kg群の雌雄に認められた．

回復期間終了時には，器官重量における肝臓絶対・相対重量の高値が1000 mg/kg群の雌にみられたが，その程度は投与期間終了時に比べ軽減した．

この他，体重測定，摂餌量測定，血液学検査，尿検査の結果には，被験物質投与に起因すると考えられる変化はみられなかった．

以上，雌雄いずれも200および1000 mg/kg群で被験物質投与に起因すると考えられる変化が認められた．一般状態において200 mg/kg群の雌雄で流涎がみられたことから，本試験条件下における2-クロロフェノールの無影響量(NOEL)は，雌雄いずれも40 mg/kg/dayと判断した．

方法

1.　被験物質

イヌイ(株)(大阪)から提供された2-クロロフェノール(ロット番号OJL-15，純度99.49 %)を室温・密栓条件下で保存し使用した．被験物質の安定性は，被験物質提供者より保証する資料を入手し，確認した．被験物質はオリブ油(丸石製薬(株))に溶解調製し，投与液とした．投与液の調製は週1回行い，投与に供するまで冷蔵保存した．投与液中の被験物質の冷蔵保存条件下での8日間の安定性は，投与開始前に0.4から200 mg/mLの範囲で確認した．また，初回調製時に各用量群の投与液を分析し，被験物質の濃度が設定濃度± 10 %以内であることを確認した．

2.　試験動物および動物飼育

日本チャールス・リバー(株)からCrj:CD(SD)IGSラット(SPF)を入手し，9日間検疫・馴化した．投与開始前日に，体重層別化無作為抽出法によって各群の体重がほぼ均一となるように群分けした．1群の動物数は，雌雄各6匹とし，対照群，200および1000 mg/kg群については雌雄各6匹の回復群(回復期間14日間)を設けた．投与開始時の週齢は5週齢，体重範囲は雄が153〜174 g，雌が126〜149 gであった．

検疫・馴化期間を含む全飼育期間を通して，温度22 ± 2 ℃，相対湿度55 ± 15 %，換気約12回/時(オールフレッシュエアー供給)，照明12時間/日(7:00〜19:00)に自動調節した飼育室を使用した．動物を実験動物用床敷(ベータチップ，日本チャールス・リバー(株))を敷いたポリカーボネート製ケージに群分け前はケージあたり5匹(同性)，群分け以降はケージあたり2匹(同性)収容し，飼育した．動物には，実験動物用固型飼料(MF，オリエンタル酵母工業(株))と，5 μmのフィルター濾過後，紫外線照射した水道水を自由に摂取させた．

3.　投与量および投与方法

急性毒性試験の予備試験として被験物質を0，250，500および1000 mg/kgの用量で単回経口投与(絶食下)した結果，死亡例は認められなかったが，投与日に自発運動の低下および歩行異常が全被験物質投与群で，間代性痙攣が500および1000 mg/kg群で認められた．次に0，100，200および500 mg/kgの用量を14日間反復経口投与した結果，いずれの群にも被験物質投与に起因すると考えられる明らかな毒性変化は認められなかった．これらの予備試験の結果から，本試験の高用量はガイドラインの上限である1000 mg/kgとし，以下公比5で200，40および8 mg/kgの計4用量群を設定した．さらに溶媒(オリブ油)のみを投与する対照群を設けた．

投与期間は28日間とし，胃ゾンデを装着したシリンジを用いて1日1回，午前中に強制経口投与した．投与液量は10 mL/kgとし，至近日に測定した体重に基づいて算出した．

4.　観察および検査方法

下記の項目を検査した．なお，日と週の表記は投与開始日を第1日，第1〜7日を第1週とした．また，第29日以降を回復期間とした．

1)　一般状態，体重および摂餌量

全例について一般状態を毎日観察した．体重および摂餌量は投与開始日およびその後毎週1回測定した．摂餌量については各期間毎の1匹あたりの1日平均摂取量を算出した．

2)　血液学検査

第29日(最終投与日の翌日)および第43日(回復期間終了後)に全例を非絶食条件下で，チオペンタールナトリウムによる麻酔下で後大静脈より採血し，赤血球数(シースフローDCインピーダンス検出法)，ヘモグロビン濃度(SLSヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(赤血球パルス波高値検出法)，血小板数(シースフローDCインピーダンス検出法)，白血球数(RF/DCインピーダンス検出法)を多項目自動血球分析装置(NE-4500，シスメックス(株))で，網赤血球率(アルゴンレーザーを用いたフローサイトメトリー法)を自動網赤血球測定装置(R-2000，シスメックス(株))で，プロトロンビン時間(PT;Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT;活性化セファロプラスチン法)を血液凝固自動測定装置(KC 10A，アメルング社)で，白血球百分率(Wright染色塗抹標本)を血液細胞自動分析装置(MICROX HEG-70A，オムロン(株))で，それぞれ測定した．また，検査の結果から平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)，平均赤血球血色素濃度(MCHC)を算出した．プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間の測定には凝固阻止剤として3.2 %クエン酸三ナトリウム水溶液を使用し，遠心分離して得られた血漿を用いた．その他の項目の測定には，凝固阻止剤EDTA-2Kで処理した血液を用いた．

3)　血液生化学検査

第29日(最終投与日の翌日)および第43日(回復期間終了後)に採取した血液の一部を室温で約30分間静置後3000 rpmで10分間遠心分離し，得られた血清を用いて，ASAT(GOT;JSCC改良法)，ALAT(GPT;JSCC改良法)，gGT(SSCC改良法)，ALP(JSCC改良法)，総ビリルビン(BOD法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaff法)，グルコース(GlcK-G6PDH法)，総コレステロール(CES-CO-POD法)，トリグリセライド(LPL-GK-G3PO-POD法)，総蛋白(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(PNP-XOD-POD法)，ナトリウム，カリウム，クロール(イオン選択電極法)を自動分析装置(日立736-10形;(株)日立製作所)により測定した．また，検査の結果からA/G比を算出した．

4)　尿検査

各群雌雄6匹の新鮮尿を第26日(投与期間最終週)に採取して，pH，蛋白，グルコース，ケトン体，ビリルビン，潜血，ウロビリノーゲン(試験紙法;マルティスティックス，バイエル・三共(株))を尿分析装置(クリニテック100，バイエル・三共(株))で測定した．

5)　病理学検査

第29日(最終投与日の翌日)および第43日(回復期間終了後)に全例について，採血後，腹大動脈を切断・放血し，安楽死させた後剖検した．全例の脳，心臓，肺，肝臓，腎臓，副腎，胸腺，脾臓，精巣，卵巣，子宮，精巣上体，下垂体，甲状腺の重量を測定した．ただし，投与期間終了時の剖検で200 mg/kg群の雄1例の下垂体を破損したため，本例の下垂体重量データは除外した．全例の脳，脊髄，下垂体，眼球およびハーダー腺，リンパ節(下顎・腸間膜)，胸腺，気管，肺および気管支，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，膵臓，甲状腺および上皮小体，心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，膀胱，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺腹葉，卵巣，子宮，大腿骨および骨髄，大腿筋および坐骨神経を採取し，眼球とハーダー腺はダビドソン液で，精巣および精巣上体はブアン液で，それ以外の器官・組織は10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定し，保存した．

投与期間終了時に採取した対照群と1000 mg/kg群の雌雄全例の胸腺，心臓，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体，精嚢，卵巣，脳，脊髄(頚部，胸部，腰部)，坐骨神経，大腿筋ならびに対照群を含む全動物の肉眼的異常部位は常法に従ってヘマトキシリン・エオジン(H.E)染色標本を作製し，鏡検した．また，肝臓については投与期間終了時解剖動物の8，40および200 mg/kg群と回復期間終了時解剖動物の全群の雌雄についても鏡検した．さらに，対照群と1000 mg/kg群の雌雄各2例の脳および脊髄について，クリューバー・バレラ染色標本を作製し，鏡検した．

5.　統計解析

計量データは，Bartlett法で等分散の検定を行い，分散が等しい場合は一元配置分散分析，分散が等しくない場合はKruskal-Wallisの検定を行った．群間に有意な差が認められた場合はDunnett法またはDunnett型の多重比較検定を行った．尿検査データおよび病理組織所見は，a × bのx2検定を行い，有意差が認められた場合はArmitageのx2検定で対照群と各用量群を比較した．有意水準は5 %とした．

結果

1.　一般状態

1000 mg/kg群では第1日から自発運動の低下と歩行異常がみられた．歩行異常は雄4例に第1日のみ，雌7例に第1日から10日にかけてみられた．自発運動の低下は雄8例，雌6例に投与期間中散発的に認められ，投与期間後半には腹臥位あるいは側臥位もみられた．また，流涎が雄8例，雌10例で第9日以降に，振戦が雄4例で第15日以降に，雌5例で第12日以降に散発的にみられた．これらはいずれも投与後の一過性の変化であり，自発運動の低下，腹臥位および側臥位は投与後3時間以内，歩行異常，流涎，振戦，側臥位は投与後30分以内に消失した．200 mg/kg群では流涎が雄6例で第13日以降，雌1例で第12日以降にみられたが，投与後30分以内に消失する一過性の変化であった．回復期間中には，これらの変化は認められなかった．

2.　体重(Fig. 1)

いずれの被験物質投与群においても，対照群と同様に推移した．

3.　摂餌量(Fig. 2)

いずれの被験物質投与群においても，対照群と同様に推移した．

4.　血液学検査(Table 1)

投与期間終了時および回復期間終了時の検査で，被験物質投与に起因すると思われる変化は認められなかった．

回復期間終了時に白血球百分率の分葉核好中球比の高値および単球比の低値が1000 mg/kg群の雄でみられたが，軽微な変化であり，投与期間終了時にはみられないことから，被験物質投与とは関連のない変化と判断した．

5.　血液生化学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査で，無機リンの低値が1000 mg/kg群の雄で，トリグリセライドの高値が1000 mg/kg群の雌で認められた．これらの変化はいずれも軽微であり，また，回復期間終了時にはみられなかった．

回復期間終了時にALPの高値が1000 mg/kg群の雄で，尿素窒素の低値が200 mg/kg群の雌でみられたが，軽微な変化であり，投与期間終了時にはみられないことから，被験物質投与とは関連のない変化と判断した．

6.　尿検査(Table 3)

投与期間最終週の検査で，変化は認められなかった．

7.　器官重量(Table 4)

投与期間終了時の検査で，肝臓絶対・相対重量の高値が1000 mg/kg群の雌で認められた．これらの変化は回復期間終了時にもみられたが，投与期間終了時に比べその程度は軽減していた．

回復期間終了時に下垂体絶対・相対重量の低値が200 mg/kg群の雄で，下垂体絶対重量の低値が1000 mg/kg群の雄で，脳絶対重量の低値が1000 mg/kg群の雄でみられた．しかし，いずれも軽微な変化であり，投与期間終了時にはみられないことから，被験物質投与とは関連のない変化と判断した．

8.　剖検所見

投与期間終了時の検査で肝臓の褐色化が1000 mg/kg群の雄6例，雌4例で，副腎の腫大が1000 mg/kg群の雌4例で認められた．本変化は回復期間終了時にはみられなかった．

投与期間終了時および回復期間終了時に被験物質投与群で，偶発変化と思われる種々の変化が散見された．

9.　病理組織学所見(Table 5)

被験物質投与に起因すると思われる変化として，小葉中心性の肝細胞肥大が投与期間終了時の剖検動物の1000 mg/kg群の雄全例と雌5例で認められた．回復期間終了時の解剖動物では，本変化が認められなかった．

投与期間終了時の剖検で副腎の腫大がみられた1000 mg/kg群の雌では，病理組織学的に対応する変化は認められなかった．また，一般状態観察で振戦が認められたため，脳，脊髄，坐骨神経および大腿筋のH.E染色標本を作製，さらに，脳および脊髄については，クリューバー・バレラ染色標本を作製し鏡検したが，異常は認められなかった．

投与期間終了時および回復期間終了時に被験物質投与群で，偶発変化と思われる種々の変化が散見された．

考察

2-クロロフェノールを0，8，40，200および1000 mg/kgの用量で雌雄のSD系ラットに28日間反復経口投与し，その毒性と回復性を検討した．

一般状態において，投与期間中に振戦，自発運動の低下，歩行異常，腹臥位あるいは側臥位が1000 mg/kg群の雌雄，流涎が200および1000 mg/kg群の雌雄に認められた．これらの変化は投与後にのみ起こる一過性の変化であった．振戦は中枢神経系障害に起因するものと考えられるが，病理組織学的に脳，脊髄に異常はみられなかった．なお，ラットにクロロフェノールを投与した場合，振戦が起こることはすでに報告がされている3)．流涎については，被験物質の口腔粘膜刺激あるいは1000 mg/kg群で振戦がみられることから，中枢神経障害に起因する可能性が疑われるが，その原因は明らかではなかった．これらの変化は回復期間中にはみられなかった．

器官重量において，肝臓絶対・相対重量の高値が1000 mg/kg群の雌で認められた．肝臓では，剖検で褐色化が，病理組織学検査で小葉中心性の肝細胞肥大が1000 mg/kg群の雌雄で認められた．小葉中心性の肝細胞肥大は，薬物代謝酵素が誘導された場合にしばしば発現することが知られている4)．このことから，これらの肝臓の変化は，薬物代謝酵素が誘導されたことによる適応性変化である可能性が考えられる．回復期間終了時には，肝臓絶対・相対重量の高値が1000 mg/kg群の雌にみられたが，その程度は投与期間終了時に比べ軽減し，剖検および病理組織学検査でも肝臓に異常はみられなかったことから，これらの変化は投与を中止することにより回復するものと考えられる．

血液生化学検査において，投与期間終了時に無機リンの低値が1000 mg/kg群の雄，トリグリセライドの高値が1000 mg/kg群の雌に認められた．しかし，いずれも軽微な変化であることや，その他の関連パラメータに異常がないことから，毒性学的には意義の低い変化と考えられる．

剖検において，投与期間終了時に副腎の腫大が1000 mg/kg群の雌でみられた．しかし，副腎絶対・相対重量には有意な変動がなく，病理組織学検査で対応する変化はみられないことから，被験物質投与に起因した変化ではないと判断した．

体重測定，摂餌量測定，血液学検査，尿検査の結果には，被験物質投与に起因すると考えられる変化はみられなかった．

以上，雌雄いずれも200および1000 mg/kg群で被験物質投与に起因すると考えられる変化が認められた．一般状態において200 mg/kg群の雌雄で流涎がみられたことから，本試験条件下における2-クロロフェノールの無影響量(NOEL)は，雌雄いずれも40 mg/kg/dayと判断した．

文献

1)化学工業日報社編，“1994年度版 新化学インデックス，”化学工業日報社，東京，p.198.
2)荒木峻，沼田眞，和田攻編，“環境科学事典，”東京化学同人，東京，1985, p.209.
3)後藤稠，池田正之，原一郎編，“産業中毒便覧(増補版)，”医歯薬出版，東京，1983, pp.703-704.
4)C. Gopinath, D. E. Prentis and D. J. Lewis, “Atlas of Experimental Toxicological Pathology,” eds. by C. Gopinath, D. E. Prentis and D. J. Lewis, MTP Press, Lancaster, 1987, pp.43-60.

連絡先
試験責任者：山下弘太郎
試験担当者：伊勢記代子，武知雅人，豊田直人，鈴木美江
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Kotaro Yamashita(Study director)
Kiyoko Ise, Masato Takechi, Naoto Toyota, Yoshie Suzuki
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255 Japan
Tel +81-479-46-2871Fax +81-479-46-2874