o-ジクロロベンゼンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of o-Dichlorobenzene on Bacteria

要約

o-ジクロロベンゼンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100, TA98, TA1535, TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．試験は2回繰り返して実施し，S9 mix無添加群のTA100で2.44〜78.1 μg/plate，同群のその他の菌株およびS9 mix添加群の各試験菌株でそれぞれ9.77〜313 μg/plateの6用量で試験を実施した．

その結果，S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．

以上の結果より，本試験条件下ではo-ジクロロベンゼンは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．

方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100, TA98, TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成11年1月5日ならびに平成11年3月31日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80 ℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5 %の寒天(OXOID:No. 1)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5 %を含む0.6 % Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 %ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37 ℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4.　S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
成　　分S9 mix 1 mL中の量
S90.1 mL
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
精製水残　量

5.　被験物質

o-ジクロロベンゼン(ロット番号:8803302)は純度99.7 %の無色透明液体である．本剤は20 ℃の水100 mLに0.013 g溶解し，ほとんどの有機溶剤に可溶であり，DMSO溶液中で安定である．三井化学(株)(東京)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質液の調製

試験の都度，モレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSO(MERCK KGaA)で被験物質を溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．なお，本被験物質情報から揮発性が疑われたため，調製には蓋付きの試験管を用いた．

7.　試験用量の設定

19.5，78.1，313および1250 μg/plateの用量を用いて予備的な試験を実施した．S9 mix無添加群のTA100で78.1 μg/plate以上，同群のその他の菌株ならびにS9 mix添加群の全菌株で313 μg/plate以上において試験菌株に対する生育阻害作用が観察された．

従って，本試験においてはS9 mix無添加群のTA100で78.1 μg/plate，同群のその他の菌株ならびにS9 mix添加群の各試験菌株で313 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．

8.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20 ℃)した．
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich社)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株))

9.　試験方法

Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．蓋付き試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/Lナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加した．さらに，試験菌液100 μLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．各プレートをビニールテープで密封して，37 ℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．また，独立して試験を2回実施した．

10.　結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

1回目の試験結果をTable 1〜2に，2回目の試験結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群のいずれにおいても，高用量群においてo-ジクロロベンゼン処理による生育阻害作用が観察された．しかしながら，復帰突然変異コロニー数については，S9 mix無添加群，S9 mix添加群とも溶媒対照と同等の値であり，明確な増加傾向は認められなかった．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，コロニー計数時，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．以上の試験結果から，本試験条件下において，o-ジクロロベンゼンの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．

なお，本被験物質についてはすでにAmes試験で陰性3)との報告がある．一方，ヒト鼻粘膜細胞に染色体異常を誘発する4)との報告がある．類縁体であるp-ジクロロベンゼンについてはAmes試験で陰性5)，染色体異常試験で陰性6)，ヒトリンパ球に対して姉妹染色体交換を誘発する7)との報告があるが，m-ジクロロベンゼンの変異原性に関する報告はなかった．

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutation Research, 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976).
3)石館基監修，“微生物を用いる変異原性試験データ集，”エル・アイ・シー，東京，1991, pp.164-165.
4)C. Zapata-Gayon, N. Zapata-Gayon and A. Gonzalez-Angulo, Arch. Environ. Health, 37(4), 231(1982).
5)E. Loeser and M. H. Litchfield, Food Chem. Toxicol., 21(6), 825(1983).
6)石館基監修，“<改訂>染色体異常試験データ集，”エル・アイ・シー，東京，1987, p.123.
7)E. Carbonell, M. Puig, N. Xamena, A. Creus and R. Marcos, Mutat. Res., 263(1), 57(1991).

連絡先
試験責任者：益森勝志
試験担当者：板倉真由実，菊池正憲
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Shoji Masumori(Study Director)
Mayumi Itakura, Masanori Kikuchi
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-Pyo Center)
582-2 Arahama, Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393