N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドの
ラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of
N-Cyclohexyl-2-benzothiazolesulfenamide in Rats

要約

N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドは，主にゴムの加硫促進剤として用いられている化学物質である．この物質の毒性について，ラットにおける単回経口投与によるLD50値は 5300 mg/kg1)で，ラットを用いた混餌投与による催奇形性試験では，0.5％濃度で親動物に体重増加抑制および摂餌量の減少が認められ，胎児体重および胎盤重量の減少は認められるが，胎児数の変化や形態的な異常は認められないことが報告2)されている．また，ヒトに対しては，アレルギー性接触皮膚炎の原因物質となりうることが知られている3)．しかしながら，本物質の反復投与による一般毒性学的影響については，明らかにされていない．今回，OECDにおける高生産量既存化学物質の安全性点検事業の一環として，N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドについて，ラットを用い，0(対照)，25，80，250および800 mg/kg/day用量で，28日間反復経口投与毒性試験を実施した．動物数は1群雌雄各6匹とし，7群を設け，5群は投与期間終了時に屠殺した．2群は0および800 mg/kgの14日間回復群とした．

一般状態では，800 mg/kg群で雌に立毛および被毛の汚れが認められた．250 mg/kg群の雌および 800 mg/kg群の雌雄には，体重増加の抑制および摂餌量の減少が認められた．尿検査では，250および 800 mg/kg群で雄にケトン体の増加が認められた．血液学検査では，250 および 800mg/kg群で雄にプロトンビン時間の短縮，800 mg/kg群で雌にヘマトクリット値，網状赤血球数および血小板数の減少が認められた．血液生化学検査では，250および800 mg/kg群で雄に総タンパクの減少，800 mg/kg群で雌雄に塩素の減少，雌にカルシウムの増加およびナトリウムの減少が認められた．剖検では，800 mg/kg群で雌に盲腸の膨満が認められた．病理組織学検査では，250および 800 mg/kg群で雄に腎臓の近位尿細管上皮における硝子滴の増加が認められ，800 mg/kg群の雌雄の腎臓相対重量は増加した．

回復群においては，雄の腎臓の病理組織学的変化は回復傾向を示し，その他の変化はいずれも回復した．

以上の結果から，N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドのラットへの 28 日間反復経口投与により，主に腎臓に対し毒性影響が認められた．無影響量は，雌雄とも 80 mg/kg/dayと推定された．

方法

1．被験物質

N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドは，分子量264.43，融点 99.3℃の灰白色粒状で，アセトン，クロロホルム，ベンゼン，トルエンに易溶，水に難溶である．試験には，大内新興化学工業(株)から提供されたロット番号508045，純度98.8％のものを用いた．被験物質は局方ゴマ油(宮澤薬品)に懸濁して，投与液とした．被験物質の原体および投与形態での安定性は確認した．

2．使用動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)より搬入したSD系〔Crj:CD(SD)〕ラットを，雄は6日，雌は7日間検疫・馴化飼育し，5週齢(雄149〜167 g，雌131〜146 g)で，1群雌雄各6匹として試験に用いた．ラットは，温度 22±3 ℃，湿度 55±10％，換気回数10回以上/時，照明12時間(6時〜18 時)に設定した飼育室で，金網ケージに個別に収容し，固型飼料〔ラボMRストック，日本農産工業(株)〕および水を自由に摂取させた．

3．投与量および投与方法

投与量設定試験は，ラットを1群雌雄各4匹とし，N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドを0，50，100，250，500 および 1000 mg/kg/day用量で 14日間反復経口投与した．250 mg/kg以上の群で血清 GPT，塩素および胸腺重量の減少，500 mg/kg以上の群で体重増加の抑制，尿のアルカリ化傾向，血小板数および心臓重量の減少，1000 mg/kg群で脱毛例の発現，摂餌量の減少，プロトロンビン時間の短縮，総ビリルビン，アルブミンおよび脾臓重量の減少，総コレステロールの増加が雌雄あるいはそのいずれかに認められた．以上の結果から，本試験における投与量は，800 mg/kg/dayを最高用量とし，以下250，80および25 mg/kg/dayの4用量を設定した．投与方法は，投与液量を体重1 kg当たり 5 mlとし，テフロン製胃ゾンデを装着した注射筒を用いて，1日1回(午前中)，28日間にわたって経口投与した．対照群には，溶媒として用いた局方ゴマ油を同様に投与した．

4．観察および検査

1)　一般状態観察

投与期間中毎日，動物の生死，外観，行動等について観察した．

2)　体重および摂餌量測定

体重は，投与1日(投与初日の投与直前)，3日およびその後は週2回，3あるいは4日ごと，ならびに剖検日に測定した．摂餌量は，毎週1回(雄は投与6，13，20，27 日および投与終了後6，13日，雌は投与5，12，17，24 日および投与終了後5，12日)，翌日までの 24 時間の飼料消費量を測定した．

3)　尿検査

雄は投与22日および投与終了後13日，雌は投与22日および投与終了後12日に，腰部を刺激して排尿させ，外観の観察およびpH，潜血，タンパク，糖，ケトン体，ビリルビン，ウロビリノーゲン［以上，マイルス・三共(株)，マルティスティックス(R)］を検査した．

4)　血液学検査

供試血液の採取は，投与期間および回復期間終了翌日における屠殺剖検時に行った．動物は採血前日の午後5時より除餌し，水のみを給与した．採取した血液は3分割し，その一部はEDTA-2Kで凝固防止処理し，多項目自動血球計数装置［東亜医用電子(株)，E-4000］により，赤血球数(電気抵抗検出方式)，血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(パルス検出方式)，平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，平均赤血球血色素濃度(以上，計算値)，白血球数および血小板数(以上，電気抵抗検出方式)を，また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blue染色)および白血球百分率(May-Giemsa染色)を測定した．さらに，一部は3.8％クエン酸ナトリウム液で処理して血漿を得，血液凝固自動測定装置(アメルング社，KC-10A)により，プロトロンビン時間(Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸活性化法)を測定した．

5)　血液生化学検査

採取した血液の一部から血清を分離し，生化学自動分析装置［日本電子(株)，JCA-VX-1000 型クリナライザー］により，総タンパク(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G 比(計算値)，グルコース，トリグリセライド，総コレステロール(以上，酵素法)，総ビリルビン(Jendrassik法)，尿素窒素(Urease-UV法)，クレアチニン(Jaff法)，GOT，GPT，γ -GTP(以上，SSCC法)，アルカリホスファターゼ(GSCC法)，カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を，電解質自動分析装置［東亜電波工業(株)，NAKL-1］により，ナトリウム，カリウムおよび塩素を測定した．

6)　病理学検査

採血に続いて剖検し，脳，下垂体，甲状腺，心臓，胸腺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣，精巣上体，卵巣を秤量した．病理組織学検査は，採取した器官を10％中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定後，対照群および800 mg/kg群では脳，下垂体，甲状腺(上皮小体含む)，胸腺，心臓，肺，肝臓，腎臓，副腎，脾臓，胃，小腸(十二指腸・空腸・回腸)，大腸(盲腸・結腸・直腸)，膵臓，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，膀胱，リンパ節(頚部リンパ節・腸間膜リンパ節)，骨髄を検査した．25，80，250 mg/kgおよび回復群については，800 mg/kg群で被験物質の投与による変化が認められた雄の腎臓を検査した．さらに，剖検で800 mg/kgの回復群に精巣の萎縮例が認められたため回復群の精巣および精巣上体も検査した．その他，肉眼的変化を示した器官については，当該個体のみ検査した．検査は，常法に従いパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した．また，沈着物を同定するため，一部の雄の腎臓についてはPAS 染色も行った．

5．統計解析

得られた平均値について，Dunnettの多重比較検定を行った．ただし，回復群については，t 検定および U 検定を行った．病理学所見の異常例の出現頻度については，Fisher の直接確率法を用いて検定した．

結果

1．死亡および一般状態

死亡は認められなかった．一般状態については，800 mg/kg群で雌の半数に立毛および下腹部等に被毛の汚れが認められた．立毛は800 mg/kg群の雄にも認められたが，1匹のみの発現であった．また，自発運動の低下が800 mg/kg群で雌の1匹に認められた．250 mg/kg以下の群では，被験物質の投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．投与とは無関係と考えられる変化として，25 mg/kg群で雄の1匹に赤色尿の排泄，自発運動低下，胸腹部被毛の尿による汚染が，また 800 mg/kg群で雌に皮膚の痂皮形成が1匹に，舌の創傷が1匹に認められた．回復期間においては，800 mg/kgの回復群で雌に投与終了翌日まで立毛が2匹，被毛の汚れが1匹に残存していたが，その後はいずれの個体にも異常は認められなかった．

2．体重(Fig.1)

800 mg/kg群で雌雄に，投与期間を通じての有意な体重増加の抑制が認められ，投与期間中の体重増加量は雄で対照群の78％，雌で65％の値であった．250 mg/kg群では，雌において，体重には有意差は認められなかったが体重増加量は対照群の80％の値で，有意に減少した．回復期間においては，800 mg/kg群の体重は回復傾向を示し，雄で投与終了後7日以降，雌で14日に対照群と比べ有意差は認められなくなった．

3．摂餌量

800 mg/kg群の雌雄および250 mg/kg群の雌の摂餌量は，対照群に比べて少ない傾向にあり，統計学的には800 mg/kg群で雌雄の投与1週および4週，250 mg/kg群で雌の2週に有意差が認められた．回復期間においては，800 mg/kg群の雌雄の摂餌量は対照群を上回る傾向にあったが，有意な変化ではなかった．

4．尿検査所見

250 および 800 mg/kg群で雄にケトン体の有意な増加が認められた．回復期間中の検査では，800 mg/kgの回復群において，各検査項目に有意な変化は認められなかった．

5．血液学検査所見(Table 1,2)

250 および 800 mg/kg群で雄にプロトロンビン時間の有意な短縮が，800 mg/kg群で雌にヘマトクリット値，網状赤血球数および血小板数の有意な減少が認められた．800 mg/kgの回復群においては，各検査項目に有意な変化は認められなかった．

6．血液生化学検査所見(Table 3,4)

全ての被験物質投与群で雄ならびに 80，250 および 800 mg/kg群で雌に GPT，250 および800 mg/kg群で雄に総タンパク，800 mg/kg群で雌雄に塩素のいずれも有意な減少が認められた．また，800 mg/kg群で雌にカルシウムの有意な増加およびナトリウムの有意な減少が認められた．なお，塩素の有意な減少は 80 mg/kg群の雄にも認められたが，250 mg/kg群の雄では有意な変化は認められず，またその値も背景データにおける正常範囲内のものであった．800 mg/kgの回復群においては，雄に総コレステロールの有意な減少が，雌にアルブミンの有意な減少が認められた．しかし，投与期間終了時に認められた変化は認められなかった．

7．剖検所見

800 mg/kg群で雌の半数に盲腸の軽度な膨満が認められた．800 mg/kgの回復群では，盲腸に変化は認められなかった．散発的に認められた変化としては，一般状態の観察で赤色尿の排泄などを認めた25 mg/kg群の雄の1匹に，膀胱の膨満および腎臓の腫大，退色が認められた．また，80 mg/kg群の雄の1匹に肺の赤色斑，対照群および800 mg/kgの回復群のいずれも雌の1匹に胸腺の赤色斑／領域，800 mg/kgの回復群の雄の1匹に精巣の萎縮，軟化が認められた．

8．器官重量(Table 5,6)

最終体重が有意に減少した800 mg/kg群において，絶対重量の有意な減少が雌雄の心臓，胸腺および雌の脾臓に，相対重量の有意な増加が雌雄の脳，腎臓，雄の下垂体，精巣および雌の肝臓に認められた．また，最終体重が減少傾向にあった250 mg/kg群の雌においても，脾臓の絶対重量の有意な減少が認められた．しかし，絶対および相対重量に共通して一定の変化傾向を示す器官は認められなかった．これらの変化は，800 mg/kgの回復群においては，雄の胸腺の絶対重量減少および下垂体の相対重量増加，雌の心臓の絶対重量減少および脳の相対重量増加に有意差が残るものの，いずれも変化の程度は減少し，その他の器官の重量は回復した．

9．病理組織学検査所見(Table 7,8)

被験物質の投与と関連性がみられる変化が，雄の腎臓に認められた．すなわち，雄の腎臓の近位尿細管上皮には PAS 陽性硝子滴が対照群においても認められたが，250 mg/kg群の2匹および800 mg/kg群の全例で，硝子滴の数が明らかに増加し，また大きさもやや大型化する傾向にあった．25 mg/kg群の雄で，被験物質の投与とは無関係に膀胱の膨満，腎臓の腫大・退色を認めた例には，膀胱に移行上皮の過形成およびびらんが，腎臓に腎盂および尿細管の拡張が認められた．800 mg/kgの回復群においては，雄の腎臓の変化は明かな回復傾向を示した．800 mg/kgの回復群で精巣が肉眼的に萎縮，軟化していた1例には，精巣に精細管の萎縮および間細胞の過形成，精巣上体に精巣上体管中精子の減少が認められた．しかし，精巣および精巣上体の変化は回復群のその他の例には認められなかった．以上の所見のほかにも，検査した各器官に変化が認められたが，いずれも散発的あるいは用量相関性がみられず，自然発生病変と考えられる所見であった．

考察

N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドのラットを用いる 28 日間反復経口投与毒性試験を実施した．

体重増加の抑制および摂餌量の減少が，250 mg/kg群で雌および 800 mg/kg群で雌雄に認められた．特に 800 mg/kg群の雌では一般状態の観察で立毛および被毛の汚れが半数に認められ，体重変化は顕著なものであった．

血液学検査において，800 mg/kg群で雌にヘマトクリット値，網状赤血球数および血小板数の減少が認められた．しかしこれらの変化はいずれも軽度なもので，骨髄，脾臓などに造血能低下あるいは血球破壊亢進を示唆する病理組織学的変化は認められなかった．したがって，おそらく低栄養状態に伴う二次的な変化と推察された．

腎臓に対する影響として，病理組織学検査で，近位尿細管上皮における硝子滴の用量依存的な増加が，250および800 mg/kg群で雄に認められた．雌の腎臓には病理組織学的変化は認められなかったが，800 mg/kg群で雌雄の腎臓相対重量は有意に増加した．血液生化学検査において，800 mg/kg群で認められた雌雄の塩素および雌のナトリウムの減少も，腎機能に対する影響を示唆する変化と推察される．

盲腸の膨満が 800 mg/kg群で雌に認められた．盲腸の膨満は抗菌性物質のラットへの投与によりしばしば認められ，腸内細菌叢の変化によるものと考えられている4)．本被験物質による発現機序は不明であるが，膨満の程度は軽度で，盲腸には病理組織学的変化は認められず，糞便性状の変化も認められなかった．

以上の変化に加えて，250 および 800 mg/kg群で雄にケトン体の増加，プロトロンビン時間の短縮および総タンパクの減少が，800 mg/kg群で雌にカルシウムの増加が認められたが，これらの変化はいずれも軽度なものであった．

被験物質投与各群の雌雄に認められた GPT の減少については，毒性学的意義は小さく，特に問題とすべき変化ではないと判断された．また，器官重量において，絶対重量の減少が 250 および800 mg/kg群の雌で脾臓に，800 mg/kg群の雌雄で心臓，胸腺に，相対重量の増加が 800 mg/kg群の雌雄で脳，雄で下垂体，精巣，雌で肝臓に認められた．しかしながら，これらの器官には病理組織学的変化は認められず，他に関連する変化も認められなかったことから，当該器官に対する毒性影響を示唆するものではなく，体重増加の抑制に伴う変化と考えられた．

800 mg/kgの回復群においては，これら投与期間中あるいは投与期間終了時の検査で認められた変化のうち，雄の腎臓の病理組織学的変化は回復傾向を示し，その他の変化はいずれも回復した．したがって，本被験物質の投与による毒性変化は，可逆的であると判断される．

なお，800 mg/kgの回復群で雄に総コレステロールの減少，雌でアルブミンの減少が認められたが，これらは背景データからみて正常範囲内の変化で，他に関連する変化も認められなかった．また，800 mg/kgの回復群で精巣に精細管の萎縮および間細胞の過形成，精巣上体に精巣上体管中精子の減少を認める1匹がみられたが，同群の他の例の精巣および精巣上体には異常が認められなかった．したがって，回復群で認められた変化は，遅発的な毒性の発現を示唆するものではないと考えられた．

以上の結果から，N-シクロヘキシル-2-ベンゾチアゾールスルフェンアミドのラットへの 28 日間反復経口投与により，体重，摂餌量，腎臓等に対する毒性影響が認められた．無影響量は，雌雄とも80 mg/kg/dayと推定された．

文献

1)A.R. Nutt,"Toxic hazards of rubber chemicals," Elsevier Applied Science Publishers LTD，1984，p.81.
2)M. Ema, T. Murai, T. Itami, H. Kawasaki, S. Kanoh，J. Appl. Toxicol.，9(3)，187(1989).
3)鹿庭正昭，五十嵐良明，小嶋茂雄，中村晃忠，関東裕美，伊藤正俊，石原勝，衛生化学，33(2)，140(1987).
4)小野寺威，"毒性試験講座15・医薬品," 福田英臣，秋元健，坂口孝編，地人書館，東京,1990，pp. 37-38.
連絡先
試験責任者：伊藤義彦
試験担当者：山本　譲，赤木　博，下平裕二，伊藤雅也，藩　栗緒
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-11　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 0427-62-2775Fax 0427-62-7979

Correspondence
Authors:Yoshihiko Ito(Study director)
Yuzuru Yamamoto，Hiroshi Akagi，Yuji Shimodaira，Masaya Ito， Cleo Pan
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai，Sagamihara-shi，Kanagawa，229-11 Japan
Tel +81-427-62-2775Fax +81-427-62-7979