2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 2-(4-Morpholinyldithio)benzothiazole in Bacteria

要約

2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験菌株として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．用量設定試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において2.29～5000 μg/plateの8用量，本試験ではS9 mix無添加群の各試験菌株において2.34～150 μg/plateの7用量，S9 mix添加群のTA100において18.8～600 μg/plateの6用量，同TA1535，WP2 uvrA，TA98およびTA1537において4.69～300 μg/plateの7用量で試験を実施した．

その結果，S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．なお，用量設定試験のS9 mix無添加群の全菌株ならびに本試験のS9 mix添加群のTA100において生育阻害作用のため評価できる用量が4用量に満たなかった．従って，S9 mix無添加群の各試験菌株において2.34～150 μg/plate，S9 mix添加群のTA100において4.69～300 μg/plateのそれぞれ7用量で追加試験を実施した．これら両試験系での試験結果は，用量設定試験，本試験および追加試験において再現性が確認された．

以上の結果より，本試験条件下では2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．

方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537¹⁾ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA²⁾の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のAmes BN教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成13年10月2～5日(TA100およびTA98)，平成13年10月19～22日(TA1535およびWP2 uvrA)および平成14年5月23～27日(TA1537)に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．

2．培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業)と1.5 %の寒天(伊那寒天BA-30 A)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5w/v%を含む0.6w/v% Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学)-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学)水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学)水溶液を同じく1容量加え用いた．

3．前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5w/v%ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック)を用い，37℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4．S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．

成分	S9 mix 1 mL中の量
S9	0.1 mL
MgCl₂	8 μmol
KCl	33 μmol
G-6-P	5 μmol
NADPH	4 μmol
NADH	4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol
蒸留水	残量

5．被験物質

被験物質の2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール(ロット番号:202001)は純度98.4 %の淡黄白色の固体である．本剤は水，アセトンに難溶であるが，DMSO中での分散性が良好であり，かつ同溶液中で安定である．大内新興化学(東京)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで冷蔵庫で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6．被験物質液の調製

試験の都度，被験物質をモレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSO(MERCK KGaA)を用いて懸濁あるいは溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7．試験用量の設定

2.29～5000 μg/plateの8用量(公比3)を用いて用量設定試験を実施した．S9 mix無添加群および添加群の各試験菌株でいずれの用量においても復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．生育阻害作用は，S9 mix無添加群のTA1535以外で61.7 μg/plate以上，TA1535で61.7および185 μg/plate，S9 mix添加群のTA100で556 μg/plate以上，TA1535で185, 556および1667 μg/plate，WP2 uvrA, TA98およびTA1537で185 μg/plate以上の用量において観察された．また，顕微鏡下でみられる被験物質の析出物が存在する場所は，その周辺が阻止円の様な生育阻害作用も認められた．なお，被験物質処理時，懸濁処理のため両試験法1667 μg/plate以上の用量で被験物質の残存が認められた．また，両試験法185 μg/plate以上の用量で白濁ならびに白色粉末状の析出物が認められた．コロニー計数時，S9 mix無添加群の185 μg/plate以上で白色粉末状，5000 μg/plateで白色塊状の析出物ならびに1667 μg/plate以上で被験物質の残存が観察された．また，S9 mix添加群の556 μg/plate以上で白色粉末状，5000 μg/plateで白色塊状の析出物ならびに被験物質の残存が観察された．

従って，本試験においては生育阻害作用を指標に，S9 mix無添加群の各試験菌株において150 μg/plateを最高用量とし，7用量(公比2)を，S9 mix添加群のTA100において600 μg/plateを最高用量とし，6用量(公比2)を，それ以外は300 μg/plateを最高用量とし，7用量(公比2)を設定した．

さらに，用量設定試験のS9 mix無添加群における全菌株ならびに本試験のS9 mix添加群におけるTA100において生育阻害作用のため評価できる用量が4用量に満たなかったため，試験の再現性を確認するための追加試験を実施した．S9 mix無添加群の各試験菌株においては150 μg/plateを，S9 mix添加群のTA100においては300 μg/plateを最高用量とし，それぞれ7用量(公比2)を設定した．

8．陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20℃)した．

2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業)

アジ化ナトリウム(NaN₃:和光純薬工業)

9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich)

2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業)

9．試験方法

Amesらの原法¹⁾の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/L ナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加し，さらに試験菌液100 μLを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス)を用いた．なお，用量設定試験では，S9 mix無添加群の556 μg/plate以上およびS9 mix添加群の1667 μg/plate以上の用量において，被験物質の析出により，コロニーアナライザーの使用が不適当であったため，目視で計数した．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

10．結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照の2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

用量設定試験の結果をTable 1～2に，本試験の結果をTable 3～4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群ともいずれの試験菌株においても，2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．S9 mix添加群のTA100を除く各試験菌株のいずれの処理群においても，試験菌株に対する生育阻害作用が高用量群で観察され，S9 mix添加群のTA100については低用量群から生育阻害作用が観察された．また，顕微鏡下でみられる被験物質の析出物が存在する場所は，その周辺が阻止円の様な生育阻害作用も認められた．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，被験物質処理時，両試験法75.0 μg/plate以上の用量で白色粉末状の析出物が認められた．また，S9 mix無添加群の75.0 μg/plate以上およびS9 mix添加群の150 μg/plate以上で白濁が認められた．コロニー計数時，析出物は目視で観察されなかった．また，用量設定試験でのS9 mix無添加群の全菌株および本試験でのS9 mix添加群のTA100において生育阻害作用のため評価できる用量が4用量に満たなかった．従って，試験の再現性を確認するために追加試験を実施し，結果をTable 5～6に示した．いずれの菌株においても2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．各試験菌株のいずれの処理群においても，試験菌株に対する生育阻害作用が高用量群で観察された．また，顕微鏡下でみられる被験物質の析出物が存在する場所は，その周辺が阻止円の様な生育阻害作用も認められた．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，被験物質処理時，両試験法75.0 μg/plate以上の用量で白色粉末状の析出物が認められた．また，S9 mix無添加群の75.0 μg/plate以上およびS9 mix添加群の150 μg/plate以上で白濁が認められた．コロニー計数時，析出物は目視で観察されなかった．

以上の試験結果から，本試験条件下において，2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾールの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．

なお，本被験物質[2-(4-モルホリニルジチオ)ベンゾチアゾール]について，Ames試験で陰性との報告³⁾があった．類縁体であるbenzothiazolについてもAmes試験で陰性との報告³⁾があった．さらに，類縁体であるMorpholineについてもAmes試験および染色体異常試験で陰性結果 ^{4, 5)}であったが，長期毒性試験で経口投与されたラットの肝臓と肺に腫瘍が少し認められたとの報告⁵⁾があった．

文献

1)	Maron DM, Ames BN: Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res, 113:173-215(1983)．
2)	Green MH, Muriel WJ: Mutagen testing using TRP⁺ reversion in Escherichia coli. Mutation Res, 38:3-32(1976)．
3)	HPV Chemical Challenge Program: Benzothiazole-based thiazoles Category, American Chemistry Council. Available from URL:http://www.epa.gov/chemrtk/bnzthict/c13324tc.htm, November, 2001.
4)	労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課(監修):労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，日本化学物質安全・情報センター，東京(1996)p.68.
5)	Morpholine. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum, 47:199-213(1989)．

連絡先

試験責任者：益森勝志

試験担当者：赤星まゆみ，尾崎伸也，
仲村渠奈美子，田中　仁

（財）食品農医薬品安全性評価センター

〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田582-2

Tel 0538-58-1266 Fax 0538-58-1393

Correspondence

Authors: Shoji Masumori(Study Director)
Mayumi Akahoshi, Shin-ya Ozaki,
Namiko Nakandakari, Jin Tanaka

Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)

582-2 Shioshinden , Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan

Tel +81-538-58-1266 Fax +81-538-58-1393

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