4,4'-ビフェニルジオールのチャイニーズ・ハムスター肺由来細胞(CHL/IU細胞)を用いる染色体異常試験を実施した．

　S9 mix非存在下および存在下で短時間処理(6時間処理後18時間の回復時間)した場合，増殖率がやや低下したが，50 %を越える増殖抑制作用は認められなかった．24時間連続処理(S9 mix非存在下)では，濃度に依存して増殖率が低下し，50 %の増殖抑制濃度は0.046 mg/mLと推定された．

　これらの結果に基づき，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理ともに1.9 mg/mL(10 mmol/L)の濃度を最高処理濃度とし，5段階の濃度群(0.12〜1.9 mg/mL，公比2)を設定し，染色体異常試験を実施した．しかしながら，すべての処理系列で分裂指数が低く，分析可能な3濃度群が得られなかったことから，0.48 mg/mLの濃度を最高処理濃度とし，6段階の濃度群(0.015〜0.48 mg/mL，公比2)を再設定し，染色体異常試験を実施した．

　細胞増殖率および分裂指数より，S9 mix非存在下および存在下ともに0.030，0.060，0.12 mg/mLについて染色体分析を行った．その結果，S9 mix非存在下で短時間処理したすべての処理群において，染色体の構造異常を有する細胞(9.0〜15.0 %)の統計学的な有意差が認められた．また，中濃度群および高濃度群では倍数性細胞(6.0 %および2.3 %)の統計学的な有意差が認められた．S9 mix存在下で短時間処理した場合においても，中濃度群および高濃度群で構造異常を有する細胞(11.0 %および16.0 %)および倍数性細胞(1.4 %および1.0 %)の統計学的な有意差が認められた．

　以上の結果より，4,4'-ビフェニルジオールは，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．

1.　細胞

　CHL/IU細胞はチャイニーズ・ハムスター，肺由来で，リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在23代)した．試験には，解凍後継代10代以内で試験に用いた．仔牛血清(CS，Cansera International)を10 vol%添加したイーグルMEM(日水製薬)培養液を用い，CO2インキュベーター(37℃，5 % CO2)内で培養した．

2.　S9 mix

　S9(キッコーマン)は，フェノバルビタールと5,6-ベンゾフラボンを投与した雄Sprague-Dawley系ラットの肝臓から調製したものを購入した．S9 mixは使用時に調製し，処理培地に10 vol%添加し，各成分の最終濃度はS9 5 vol%，グルコース-6-リン酸(Sigma Chemical) 0.83 mmol/L，b-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(オリエンタル酵母工業)0.67 mmol/L，MgCl2 0.83 mmol/L，KCl 5.5 mmol/L，HEPES緩衝液(pH 7.2)0.67 mmol/Lとした．

3.　被験物質

　被験物質である4,4'-ビフェニルジオール [ロット番号:020411，純度:99.96 %，本州化学工業(和歌山)] は白色結晶であり，本州化学工業から提供された後，密閉し，遮光下で室温保管した．また，被験物質は実験期間中安定であったことが，被験物質提供者において確認された．

4.　被験物質の調製

　被験物質は用時調製して試験に用いた．溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業)を用いて原液を調製した(細胞増殖抑制試験では190 mg/mL，染色体異常試験では48 mg/mLおよび190 mg/mL)．ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の1 vol%になるように加えた．なお，被験物質を溶媒に溶解させた際，発熱，発泡，変色などの変化はなかった．

5.　培養条件

　2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mLを入れたガラスディッシュ(直径6 cm)に播き，CO2インキュベーター内で3日間培養した．その後，連続処理では，新鮮培地と交換後，被験物質を加え，24時間処理した．また，短時間処理では，血清入りの培地によりS9 mix非存在下および存在下で6時間処理し，リン酸緩衝塩類溶液で洗浄，新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

6.　細胞増殖抑制試験

　染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖におよぼす影響を調べた．

　いずれの処理条件においても，1.9 mg/mL(10 mmol/L)を最高処理濃度とし，0.015〜1.9 mg/mLの濃度範囲(公比2，8濃度)で処理を行った．なお，処理開始時および処理終了時ともに0.24 mg/mL以上の濃度で肉眼観察により沈殿が認められた．

　培養終了後，10 vol %ホルマリン溶液で細胞を固定し，0.1 %クリスタルバイオレット液で染色した．単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業)を用い，溶媒を添加した溶媒対照群と比較した各処理群の相対増殖率を計測した．細胞増殖抑制試験では，各用量2枚のディッシュを用いた．処理系列は溶媒対照群と被験物質処理群とした．

　その結果，S9 mix非存在下および存在下で短時間処理した場合には，1.9 mg/mL(10 mmol/L)においても50 %を越える増殖抑制作用は認められなかった(Fig. 1)．24時間連続処理した場合，50 %の増殖抑制濃度は0.046 mg/mLと推定された(Fig. 1)．

7.　実験群の設定

　細胞増殖抑制試験の結果より，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理群では1.9 mg/mL(10 mmol/L)を最高処理濃度とし，公比2で5濃度(0.12，0.24，0.48，0.95，1.9 mg/mL)設定した．しかしながら，分裂指数が低く，分析可能な3濃度群が得られなかったことから，0.48 mg/mLを最高処理濃度とし，公比2で6濃度(0.015，0.030，0.060，0.12，0.24，0.48 mg/mL)を再設定した．

　陽性対照群については，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理では，マイトマイシンC(MMC，協和醗酵工業)およびシクロホスファミド(CP，Sigma Chemical)溶液を日局注射用水(大塚製薬工場)で調製し，最終濃度がそれぞれ0.1 μg/mLおよび10 μg/mLとなるように添加した．

　染色体異常試験においては，各用量4枚のディッシュ(陽性対照群では2枚)を用いた．陽性対照群以外では2枚のディッシュを用い染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖を測定した．処理系列は溶媒対照群，陽性対照群および被験物質処理群とした．

8.　染色体標本作製法

　培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が0.1 μg/mLになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本は3 vol%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

　細胞増殖率と分裂指数を細胞毒性の指標として，20 %以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに0.5 %以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，観察可能な最高濃度は，S9 mix 非存在下および存在下の短時間処理ともに0.12 mg/mLであったことから，この濃度を高濃度群として3濃度群を観察対象とした．

　作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会・哺乳動物試験研究会(MMS)1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(染色体数が38本以上)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　判定

　染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒対照群と被験物質処理群および陽性対照群間でフィッシャーの直接確率法2)により，有意差検定を実施した(p<0.01，片側)．また，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3)(p<0.01，片側)を行った．これらの検定結果を参考とし，生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った．

　4,4'-ビフェニルジオールは，S9 mix非存在下で短時間処理した場合，濃度依存性は認められなかったが，すべての処理群において観察した細胞の9.0〜15.0 %で染色体の構造異常が認められ，いずれも統計学的に有意であり，陽性の結果が得られた(Table 1)．また，中濃度群および高濃度群においては，倍数性細胞(6.0 %および2.3 %)が統計学的に有意に増加し，陽性の結果が得られた(Table 1)．S9 mix存在下で短時間処理した場合には，中濃度群および高濃度群で構造異常を有する細胞の統計学的に有意な増加(11.0 %および16.0 %)が認められ，陽性の結果が得られた(Table 2)．また，倍数性細胞についても，中濃度群および高濃度群(1.4 %および1.0 %)で統計学的に有意な増加が認められた(Table 2)．倍数生細胞の出現率は低いものの，S9 mix非存在下の短時間処理の結果も考慮して，陽性と判断した．

　以上のように，陽性の結果が得られたことから，D20値4)を求めたところ，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理における構造異常に関するD20値はそれぞれ0.33 mg/mLおよび0.14 mg/mLとなった．倍数性細胞については，S9 mix非存在下および存在下の短時間処理ではそれぞれ0.79 mg/mLおよび2.3 mg/mLとなったが，S9 mix存在下の短時間処理については，染色体分析を行った高濃度(0.12 mg/mL)の10倍以上の濃度であることから対象外となった．

　陽性対照物質として用いたMMCは，S9 mix非存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発し(Table 1)，CPはS9 mix存在下で短時間処理した場合において染色体の構造異常を誘発した(Table 2)．これらの陽性対照物質の結果より，本実験系の成立が確認された．

　なお，4,4'-ビフェニルジオールについては，当研究所で実施した細菌を用いる復帰突然変異試験で陰性の結果が得られている5)．4,4'-ビフェニルジオールの2つの水酸基のないbiphenylについては復帰突然変異試験で陰性6)，染色体異常試験ではマウスS9を用いた場合に陽性7)の結果が報告されている．また，biphenylに水酸基が1つ結合したo-phenylphenolと水酸基が2つ結合した2,5-dihydroxybiphenylについては染色体異常試験で連続処理条件下では陰性の結果が得られている8, 9)．これらのことから，biphenylに結合する水酸基の数や位置によって染色体異常誘発作用が異なると考えられる．

　以上の結果より，4,4'-ビフェニルジオールは，本試験条件下でCHL/IU細胞に染色体異常を誘発すると結論した．

連絡先
	試験責任者:	田中憲穂
	試験担当者:	山影康次，高橋俊孝，若栗　忍， 渡辺美香，中川ゆづき，橋本恵子，三枝克彦，加藤初美
	7食品薬品安全センター秦野研究所
	〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
	Tel 0463-82-4751	Fax 0463-82-9627

Correspondence
	Authors:	Noriho Tanaka(Study director) Kohji Yamakage, Toshitaka Takahashi, Shinobu Wakuri, Mika Watanabe, Yuzuki Nakagawa, Keiko Hashimoto, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato
	Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
	729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
	Tel +81-463-82-4751	Fax +81-463-82-9627