細胞増殖抑制試験結果をもとに，連続処理法の24時間処理で1600 μg/mL，48時間処理で800 μg/mL，短時間処理法の-S9処理で5000 μg/mLおよび同+S9処理では625 μg/mLを最高処理濃度とした．連続処理法の24時間処理は，最高処理濃度の1/4，1/8および1/16を，48時間処理では最高処理濃度の1/2，1/4，1/8をそれぞれ高濃度，中濃度および低濃度とした．また，短時間処理法の-S9処理で最高処理濃度の1/2および1/4をそれぞれ中濃度および低濃度とし，+S9処理では最高処理濃度の1/8，1/16，1/32をそれぞれ高濃度，中濃度および低濃度として設定した．連続処理法では，S9 mix非存在下における24時間および48時間連続処理後，短時間処理法ではS9 mix存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．
その結果，連続処理法の48時間処理ならびに短時間処理法の+S9処理で，染色体構造異常の誘発作用が認められた．
また，連続処理法の高用量群では分裂機構障害を示唆するC-分裂(C-mitosis)の出現が多数認められたことから，連続処理法の48時間処理で最高処理濃度を1600 μg/mLとした確認試験を実施した．最高処理濃度および最高処理濃度の1/2，1/4，1/8を設定した．
その結果，倍数性細胞の誘発作用が認められた．
さらに，連続処理法の24時間処理では染色体構造異常の出現頻度が10 %未満の増加を示し，短時間処理法の+S9処理では明確な用量依存性が認められなかった事から，最高処理濃度をそれぞれ900 μg/mLおよび160 μg/mLとした追加試験を実施した．連続処理法の24時間処理で最高処理濃度より公差100で6段階減じた7用量，短時間処理法の+S9処理では最高処理濃度より公差20で5段階減じた6用量を設定した．
その結果，いずれの処理群においても試験用量に依存した染色体構造異常の誘発作用が認められた．
以上の結果より，本試験条件下では2,4-ジアミノ-6-フェニル-s-トリアジンは，染色体異常を誘発する(陽性)と結論した．
細胞を10 vol%中性緩衝ホルマリン液(和光純薬工業(株))で固定した後，0.1 w/v%クリスタル・バイオレット(関東化学(株))水溶液で10分間染色した．色素溶出液(30 vol%エタノール，1 vol%酢酸水溶液)を適量加え，5分間程度放置して色素を溶出した後，580 nmでの吸光度を測定した．各用量群について溶媒対照群での吸光度に対する比，すなわち細胞生存率を算出した．
その結果，連続処理法において顕著な細胞増殖抑制が観察されたが，短時間処理法においては明確な細胞増殖抑制は観察されなかった(Fig. 1)．プロビット法を用いて算出した50 %細胞増殖抑制濃度は連続処理法24時間処理で219 μg/mL，同48時間処理で190 μg/mLであった．
また，連続処理法の高用量群では，分裂機構障害を示唆するC-mitosisの出現が多数認められたことから，連続処理法48時間処理で確認試験を実施した．1600 μg/mLを最高用量とし，以下公比2で減じた4用量を設定した．
さらに，連続処理法の24時間処理では染色体構造異常の出現頻度が10%未満の増加を示し，短時間処理法の+S9処理では明確な用量依存性が認められなかった事から，最高処理濃度をそれぞれ900 μg/mLおよび160 μg/mLとした追加試験を実施した．連続処理法の24時間処理で最高処理濃度より公差100で6段階減じた7用量，短時間処理法の+S9処理では最高処理濃度より公差20で5段階減じた6用量を設定した．
なお，陽性対照として，連続処理法の場合，マイトマイシンC(MMC:協和醗酵工業(株))を，24時間処理で0.05 μg/mL，48時間処理で0.025 μg/mLの用量で，短時間処理法の場合，シクロホスファミド(CP:塩野義製薬(株))を，12.5 μg/mLの用量で試験した．
すべての標本をブラインド処理した後，観察した．
各試験群の構造異常を有する細胞あるいは倍数性細胞の出現頻度を，石館ら3)の基準に従って判定した．染色体異常を有する細胞の出現頻度が5 %未満を陰性(-)，5 %以上10 %未満を疑陽性(±)，10 %以上を陽性(+)とした．最終的には再現性あるいは用量に依存性が認められた場合に陽性と判定した．
なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．
短時間処理法での試験結果をTable 2に示した．被験物質処理群の場合，S9 mix非存在下においてはいずれの用量においても染色体構造異常の誘発傾向は観察されなかったが，S9 mix存在下においては染色体構造異常の顕著な誘発が認められた(出現頻度は41.5 %)．また，倍数性細胞の誘発傾向はS9 mix非存在下および存在下のいずれにおいても観察されなかった．一方，陽性対照物質のCPで処理した細胞ではS9 mix存在下でのみ染色体構造異常の顕著な誘発が認められた．
連続処理法においてC-mitosisが多数認められ，数的異常の誘発性について否定できないため，48時間処理法の確認試験を実施した．ただし，被験物質に起因するC-mitosisを防ぐため，48時間の暴露期間終了時に被験物質を除去し，細胞周期1周期程度(24時間)の回復時間の後に染色体標本を作製した．その結果，被験物質処理群の場合，用量に依存した倍数性細胞の誘発が認められた(Table 3)．
連続処理法24時間処理および短時間処理法+S9処理において，染色体構造異常の出現頻度が1用量のみ高値を示したことから追加試験を実施し，結果をTable 4に示した．被験物質処理群の場合，いずれの試験系においても用量に依存した染色体構造異常の誘発が観察された．なお，連続処理法の24時間処理は，900 μg/mLにおいて被験物質の影響によりほとんどの分裂中期像がC-mitosisを呈していた．また，短時間処理法の+S9処理では，160 μg/mLにおいて被験物質の影響により観察可能な分裂中期像はほとんど存在しなかった．
変異原性の強さに関する相対的比較値であるD20値およびTR値はそれぞれ0.0456(μg/mL)および365と算出された．なお，暴露終了時，連続処理法の400 μg/mL以上および短時間処理法の100 μg/mL以上の用量で粉末状被験物質が培養液中に散在しているのが観察された．
以上の試験結果から，本試験条件下において2,4-ジアミノ-6-フェニル-s-トリアジンのチャイニーズハムスター培養細胞に対する染色体異常誘発性に関し，陽性と判定した．
なお，類縁化合物である2,4-ジアミノ-6-メチル-s-トリアジンの変異原性については，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEsherichia coli WP2 uvrAを用いた復帰突然変異試験で陰性4)と報告されている．
| 1) | A. Matsuoka, M. Hayashi and M. Ishidate Jr., Mutat. Res., 66. 277(1979). |
| 2) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス，"朝倉書店，東京，1988, pp. 31-35. |
| 3) | 石館基 監修，"＜改訂＞染色体異常試験データ集，"エル・アイ・シー社，東京，1987, pp. 19-24. |
| 4) | 労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課監修，"労働安全衛生法 有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，"社団法人 日本化学物質安全・情報センター，東京，1991, p.177. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 中嶋 圓 | ||
| 試験担当者： | 益森勝志，永井美穂，熊平智司，北澤倫世 | ||
| (財)食品農医薬品安全性評価センター | |||
| 〒437-1213 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2 | |||
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Madoka Nakajima(Study director) Shoji Masumori, Miho Nagai, Satoshi Kumadaira, Michiyo Kitazawa | |||
| Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center) | ||||
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