2-ヒドロキシベンズアルデヒドの細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2-Hydroxybenzaldehyde on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として，2-ヒドロキシベンズアルデヒドについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し，陰性の結果を得た．

検定菌として， Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAの5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により，用量設定試験を50～5000 μg/プレートの用量で行ったところ，すべての検定菌において，S9 mix無添加試験およびS9 mix添加試験で抗菌性が認められた．したがって，本試験はS9 mix無添加試験を31.3～1000 μg/プレート(TA100は15.6～500 μg/プレート，WP2 uvrAは125～4000 μg/プレート)，S9 mix添加試験を 62.5 ～2000 μg/プレート(TA100は15.6～500 μg/プレート，WP2 uvrAは125～4000 μg/プレート)の範囲で用量を設定し，試験を実施した．

その結果，抗菌性は， S9 mix無添加試験では，500 μg/プレート(TA100 およびTA1537)，1000 μg/プレート(TA98およびTA1535)および4000 μg/プレート(WP2)で，S9 mix添加試験では，500 μg/プレート(TA100)，2000 μg/プレート(TA1535，TA98およびTA1537)および4000 μg/プレート(WP2)で認められた．復帰変異コロニー数は，2回の本試験とも，用いたすべての検定菌で，いずれの用量においても増加は認められなかったことから，2-ヒドロキシベンズアルデヒドは，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は－ 80℃以下で凍結保存したものを用い，ニュートリエントブロスNo.2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

2-ヒドロキシベンズアルデヒド(CAS No. 90-02-8)は，分子量 122.12 の淡黄色液体である．試験には，セイミケミカル(株)製［ロット番号：082316，純度 95％以上(不純物：不明)］のものを，(社)日本化学工業協会から供与されたもの，使用時までガラス製容器に入れ，窒素ガスで空気と置換密栓して室温で遮光保管し用いた．

2-ヒドロキシベンズアルデヒドは，ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解性がよいことから，DMSOに20～50 mg/mlの範囲で溶解した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．

試験の開始に先立って， 2-ヒドロキシベンズアルデヒドのDMSO溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した．安定性試験においては，低濃度(156 μg/ml)溶液は本試験Ⅱで調製したものについて，また高濃度(40.0 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて，室温遮光条件下で，安定性を調べた．その結果，調製4時間後における各濃度の平均含量は，それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して，99.6および98.4％であった．また，本試験Ⅱで調製した被験物質調製液について含量測定試験を行った結果，調製後の濃度はそれぞれ低濃度は102％，高濃度は101％であった．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2	:	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド	(上野製薬(株))
SA	:	アジ化ナトリウム	(和光純薬工業(株))
9AA	:	9-アミノアクリジン	(Sigma Chem. Co.)
2AA	:	2-アミノアントラセン	(和光純薬工業(株))

AF2, 2AAはDMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを－20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSOに，SAは純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9 mixの組成〕

1)　トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

(A)	バクトアガー(Difco)	0.6％
	塩化ナトリウム	0.5％
(B)	* L-ヒスチジン	0.5 mM
	D-ビオチン	0.5 mM

*:	WP2 uvrA用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2 g
クエン酸・1水和物	2 g
リン酸水素二カリウム	10 g
リン酸一アンモニウム	1.92 g
水酸化ナトリウム	0.66 g
グルコース	20 g
バクトアガー(Difco)	15 g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む

S9**	0.1 ml
塩化マグネシウム	8 μmol
塩化カリウム	33 μmol
グルコースー6-リン酸	5 μmol
NADH	4 μmol
NADPH	4 μmol
ナトリウムーリン酸緩衝液(pH 7.4)	100 μmol

**: 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレート法により， S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った．

小試験管中にトップアガー 2ml，被験物質調製液0.1 ml，リン酸緩衝液0.5 ml(S9 mix添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った．

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施したところ，S9 mix無添加試験ではWP2 uvrA 5000 μg/プレートで，TA100が500 μg/プレート以上で，その他は1500 μg/プレート以上で抗菌性が認められた．また，S9 mix添加試験ではTA100が500 μg/プレート以上で，その他は 1500 μg/プレート以上の用量で抗菌性が認められた．

〔本試験〕

結果をそれぞれ Table 1，2に示した．2-ヒドロキシベンズアルデヒドの用量を，S9 mix無添加試験は31.3～1000 μg/プレート(TA100は15.6～500 μg/プレート，WP2 uvrAは125～4000 μg/プレート)，S9 mix添加試験は62.5～2000 μg/プレート(TA100およびWP2 uvrAはS9 mix 添加試験と同一用量)の範囲で公比を2として設定し試験を実施した．その結果，2回の試験のいずれも，用いた5種類の検定菌のS9 mix無添加試験および添加試験において，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき， 2-ヒドロキシベンズアルデヒドは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)	D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." eds, by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：坂本京子，川上久美子，原　　巧，堀谷尚古，松木容彦，中込まどか，中尾美津男，北嶋美以子

(財)食品薬品安全センター　秦野研究所

〒257 秦野市落合 729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya (Study Director)
Kyoko Sakamoto,
Kumiko Kawakami,
Takumi Hara,
Naoko Horiya,
Yasuhiko Matsuki,
Madoka Nakagomi,
Mitsuo Nakao, and Miiko kitashima

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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