チモールの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of Thymol on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，チモールの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響を評価するため，チャイニーズ・ハムスター培養細胞 (CHL/IU)を用いて試験管内染色体異常試験を実施した．

連続処理 (48時間)，短時間処理(6時間)ともに50%を明らかに越える増殖抑制濃度，すなわち0.08 mg/mlの濃度を最高処理濃度とした．最高処理濃度の1/2および1/4をそれぞれ中濃度，低濃度として設定した．連続処理では，S9 mix 非存在下における24時間および48時間連続処理後，短時間処理ではS9 mix存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．

CHL/IU細胞を24時間および48時間連続処理した高濃度群(0.08 mg/ml)では，細胞毒性のため十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．短時間処理では，S9 mix非存在下で 6時間処理した高濃度群(0.08 mg/ml)において細胞毒性のため十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下では，高濃度群(0.08 mg/ml)において，観察した細胞の5.5%に染色体異常が認められた．また，いずれの処理群においても倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

以上の結果より，チモールは，染色体異常を誘発すると結論した．

方法

1.　使用した細胞

リサーチ・リソースバンク (JCRB)から入手(1988年2月，入手時：継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．

2.　培養液の調製

培養には，牛胎児血清 (FCS：Biocell)を10%添加したイーグル MEM(日水製薬(株))培養液を用いた．

3.　培養条件

2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mlを入れたディッシュ(径 6 cm，Corning)に播き，37℃のCO2インキュベーター(5% CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．

4.　被験物質

チモール (略号：TM，CAS No.：89-83-8，ロット番号：CAN1119，和光純薬工業(株)製造)は，白色結晶で，水にやや溶け，エタノール，クロロホルム，ベンゼン，酢酸に易溶であり，融点51.5℃，沸点233.5℃，分子式 C10H14O，分子量150.22，純度98%以上(不純物として不揮発物0.05%以下，他のフェノール類(含量未定)含む) の物質である．

被験物質原体の安定性に関する情報は得られなかったが，溶媒中 (DMSO)では，156.3 μg/ml〜20.0 mg/mlの濃度範囲で 4時間安定であった．

5.　被験物質の調製

被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒は DMSO(和光純薬工業(株))を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の0.5%(v/v)になるように加えた．染色体異常試験に用いた被験物質調製液の濃度は，許容範囲内(溶媒中での平均含量が添加量の90.0〜110%)の値であった．なお濃度の記載について，純度換算は行わなかった．

6.　細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業 (株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

その結果，連続処理における 50%の増殖抑制濃度を明らかに越える濃度(約60%の増殖抑制濃度)を，60%増殖抑制濃度をはさむ2濃度より算出したところ，0.08 mg/ml であった(Fig. 1)．短時間処理のS9 mix存在下および非存在下における50%の増殖濃度を明らかに越える濃度は，ともに0.07 mg/mlであった(Fig. 2)．なお，S9 mix存在下において，高濃度になると増殖率の上昇が認められたが，これはディッシュの底面にS9もしくは被験物質と思われる沈殿が付着したためと考えられた．

7.　実験群の設定

細胞増殖抑制試験の結果， 50%の増殖抑制濃度を明らかに越える濃度は，いずれも近似していることから，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理，短時間処理とも0.08 mg/mlとし，それぞれ高濃度群の1/2の濃度を中濃度，1/4の濃度を低濃度とした．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業(株))およびシクロホスファミド(CPA，Sigma Chemical Co.)は，注射用水((株)大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

8.　染色体標本作製法

培養終了の 2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1μg/mlになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3%ギムザ溶液で染色した．

9.　染色体分析

作製したスライド標本のうち， 1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験(MMS)分科会1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については 1群800個の分裂中期細胞を分析した．

10.　記録と判定

無処理対照，陰性および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．

染色体異常を有する細胞の出現頻度について，林 2)の方法を参考にして，溶媒の背景データと被験物質処理群間でフィッシャーの直接確率法3)(多重性を考慮して familywiseの有意水準を5%とした)により，有意差検定を実施した．また，フィッシャーの直接確率法で有意差が認められた場合には，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定4)(p<0.05)を行った．原則として以上2回の検定でともに有意差が認められた場合を陽性とした．傾向性検定で有意差が認められない場合には疑陽性とした．観察細胞数が，構造異常については100個未満，倍数性細胞については400個未満の場合を細胞毒性のため判定不能とした．

結果および考察

連続処理による染色体分析の結果を Table 1に示した．チモールを加えて24時間および48時間連続処理した高濃度群(0.08 mg/ml)では，細胞毒性により十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

短時間処理による染色体分析の結果を Table 2に示した．チモールを加えてS9 mix非存在下で6時間処理した高濃度群(0.08 mg/ml)では，細胞毒性により十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下では，高濃度群(0.08 mg/ml)において観察した細胞の5.5 %(gapを含む)に染色体の構造異常が認められ，陽性の結果が得られた．また，いずれの処理群でも，倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

従って，チモールは，上記の試験条件下で，試験管内の CHL/IU細胞に弱いながら染色体異常を誘発すると結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988．
2)林　真，変異原性試験，1，255 (1992)．
3)吉村　功　編著，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ," サイエンティスト社，東京，1987．
4)吉村　功，大橋靖夫　編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析," 地人書館，東京，1992.

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，日下部博一，橋本恵子，長尾哲二，太田　亮
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka (Study director) Kohji Yamakage, Hirokazu Kusakabe, Keiko Hashimoto, Tetsuji Nagao,Ryo Ohta
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627