40 mg/kg群においても,雌雄の胃および雌の胸腺に病理組織変化が認められた.摂餌量,器官重量,雄の血液学検査および血液生化学検査においては被験物質に起因する変化は認められなかった.
新生児の検査において, 200 mg/kg群で低体重および体重増加抑制の傾向が認められた.出産児数,出産生児数,性比,出生率,4日生存率,外表,一般状態および剖検においては被験物質に起因する変化は認められなかった.
以上の結果より,チモールの反復投与毒性に関する無影響量は雌雄とも 8 mg/kg/day,生殖発生毒性に関する無影響量は,親動物に対して雌雄とも200 mg/kg/day,児動物に対しては40 mg/kg/dayと考えられる.
検疫・馴化を含めた全飼育期間中,温度 20〜25℃,湿度40〜70%,換気約12回/時,照明12時間/日(7:00〜19:00)に自動調節された飼育室を使用した.動物は実験動物用床敷(ベータチップ:日本チャールス・リバー(株))を敷いたポリカーボネート製ケージに,1ケージあたり投与開始後は1匹,交配期間中は雌雄各1匹,哺育期間は1腹で収容し,飼育した.
動物には,オートクレーブ滅菌した実験動物用固型飼料 (CRF-1:オリエンタル酵母工業(株)) および5 μmのフィルターで濾過後,紫外線照射した水道水をそれぞれ自由摂取させた.
投与期間は,雌雄とも交配前 14日間,交配期間中,および雄は剖検前日までの計43日間,雌は交尾後分娩を経て哺育3日までとし,3%アラビアゴム水溶液に懸濁させた被験物質を胃ゾンデを用いて1日1回,午前中に強制経口投与した.投与液量は5 ml/kgとし,至近測定日の体重を基に算出した.
投与液の調製はイエローランプ照明下で行い,投与に供するまで冷蔵・遮光下で保存した.投与液中の被験物質は本保存条件下で安定であること,使用した投与液にはほぼ所定量の被験物質が均一に含有されていることを確認した.
法),総ビリルビン(Jendrassik改良法),総蛋白(Biuret法),アルブミン(BCG法),A/G比(総蛋白およびアルブミンより算出),カルシウム(O-CPC法),無機リン(UV法),ナトリウム,カリウム,クロール(イオン選択電極法)を自動分析装置(日立736-10形:(株)日立製作所)により測定した.
病理組織検査は対照および 200 mg/kg群の雌雄の脳,下垂体,心臓,肝臓,脾臓,腎臓,副腎,精巣,精巣上体,前立腺および剖検で変化が認められた雌の胸腺について,常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製し,鏡検した.その結果,雌の胸腺および副腎において被験物質の影響が疑われたので雌の8および40 mg/kg群のこれらの器官について検査した.また,雄の剖検時に被験物質による肉眼的変化が胃に認められたので, 各群全例の雄の胃を検査するとともに, 雌についても対照,8,40および200 mg/kg群の各2,5,5,5例の胃を代表例として採取し,組織検査を行った.なお,一部の例の副腎についてはオイルレッドO染色を実施した.
哺育 4日の解剖時に卵巣,子宮を摘出して黄体数および着床数を検査した.交尾確認後25日を経ても分娩しない雌は剖検し,肉眼的に着床が認められない動物の子宮は2%KOH水溶液に浸漬し,着床の有無を確認した.これらの結果から,妊娠期間(妊娠0日から出産が確認された日までの期間),出産率([生児出産雌数/受胎雌数]×100),着床率([着床数/黄体数]×100),分娩率([総出産児数/着床数]×100)を算出した.
哺育 0日に出産児数,出産生児数,死産児数,性別および外表異常の有無を検査した.その後,一般状態,死亡の有無を毎日観察した.死亡動物は食殺等で検査に耐えないものを除き,10%中性リン酸緩衝ホルマリン液に浸漬・固定後,実体顕微鏡下で剖検した.哺育0および4日の生存児数から出生率([出産生児数/総出産児数]×100),4日生存率([哺育4日生児数/出産生児数]×100)を算出した.
(2) 体重
哺育 0および4日に1腹毎に雌雄単位でまとめて測定し,それぞれの平均値を算出した.また,哺育0日の体重を基準に体重増加量を算出した.
(3) 剖検
全ての生存児について哺育 4日に口腔を含む外表を検査した後,チオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で開腹し,腹大動脈切断により放血致死させ剖検した.
法またはScheff
型により多重比較を行った.計数データはFisherの直接確率法により検定した.新生児に関するデータについては,各母動物毎に算出した平均値を統計単位とした.
肥厚した前胃粘膜の表面は白色化し,粗造を呈していた.また,胸腺の小型化が40および200 mg/kg群の雌で各1例に,副腎の白色化が200 mg/kg群の雌2例に認められた.
その他,偶発的な変化として,脳室の拡張が 200 mg/kg群の雄1例に認められた.なお,8 mg/kg群の雄1例は食道穿孔の形跡が観察されたため,投与過誤があったものと判断し,全データを集計から除外した.
前胃では,粘膜上皮の増生を主体とした変化が 40および200 mg/kg群で雌雄ともに認められ,前胃粘膜は重層扁平上皮の増生および角化亢進により肥厚していた.肥厚した部分の粘膜下織に炎症性細胞の浸潤や水腫を伴う例が雄では多数,雌では少数認められた.
胸腺では,退縮が 40および200 mg/kg群の雌で各1例に認められた.この2例は,剖検時に胸腺の小型化を示した例であった.
副腎では,皮質束状帯の脂肪滴の増加が 200 mg/kg群の雌1例に認められた.この例は肉眼的に副腎の白色化を示した2例のうちの1例であった.同群の他の1例と8および40 mg/kg群の雌の副腎には変化は認められなかった.
その他に,対照あるいは被験物質投与群で認められた種々の変化については,いずれも自然発生的に観察される変化であり,発現状況に用量との関連が乏しいことから偶発病変と判断した .
哺育期間の観察において,哺育 1〜2日に投与後症状および削痩を示した200 mg/kg群の母動物では哺育1日に児の胃内乳汁量が少なく,同腹児の17例中5例が死亡した.その他にはいずれの群の母動物にも異常は認められなかった.
出産児数,出産生児数,性比,出生率および新生児生存率ともに対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった.
(2) 出生児の観察
外表異常として,無尾および臍部の膨隆が 40mg/kg群で各1例に認められたが,その他の新生児には異常は認められなかった.また,一般状態には各群いずれの新生児にも異常は認められなかった.
(3) 体重(Table 7)
200 mg/kg群において,有意差は認められなかったが,哺育0および4日の体重,ならびにその間の体重増加量が雌雄とも対照群に比べ若干低値を示した.8および40 mg/kg群においては,雌雄とも対照群とほぼ同様な値を示した.
(4) 剖検
生存動物では,胸腺の頸部残留が 8 mg/kg群で2例,臍ヘルニアが40 mg/kg群の腹部膨隆を示した例に観察されたが,他の新生児には異常は認められなかった.
死産児では,卵円孔開存が 8,40および200 mg/kg群で,各々1,2,1例に認められた.哺育1日以降の死亡例には異常は認められなかった.
雌で認められた投与後症状については,異性体である biosolおよびcarvacrolで報告されている所見と同様の変化であり1-3),いずれも投与後の時間経過とともに消失する一過性の変化であった.被験物質が属するphenol誘導体は一般に中枢抑制作用を有することが知られており4,5),被験物質も麻酔作用3)を有し,さらに筋収縮を直接抑制する作用2)もあることが報告されている.これらのことから,今回観察された投与後症状は被験物質の中枢抑制あるいは筋収縮抑制作用により発現した変化と考えられる.
病理検査において認められた前胃の変化については,肉眼的には肥厚として観察され,増生した粘膜の下織には炎症性細胞の浸潤あるいは水腫を伴うものも認められた.一般に phenol類は刺激性を有し4),被験物質および carvacrolも同様であることが報告されている1,6-8).したがって,本変化については被験物質の刺激性に起因した変化と推察される.
200 mg/kg群の雄の死亡例には,病理検査で心房の拡張,炎症性細胞の浸潤を伴ったうっ血性肺水腫,および肝臓のうっ血など循環障害を示唆する変化が認められたが,死因につながる一般状態の変化は観察されず,原因を特定することはできなかった.しかし,雌では一部の動物に投与期間後半でも投与後症状が観察されていること,さらに被験物質が血圧降下作用および呼吸抑制作用2)を有することを考慮すると,この動物には何らかの要因で被験物質の作用が一時的に強く現れ,循環器系あるいは呼吸器系に異常を来して死亡した可能性が考えられる.
この他,胸腺の退縮が 40および200 mg/kg群の雌で各1例に認められ,200 mg/kg群の動物では副腎束状帯の脂肪滴の増加を伴っていた.このうち40 mg/kg群の動物は同群の検査動物のなかで胃の変化が最も強く,また200 mg/kg群の例は分娩前後に投与後症状および削痩を示した動物であった.胸腺の退縮はストレス状態の動物に認められる変化であり9),他の動物では同様な所見は認められなかったことから,これらの変化は感受性の高い動物が妊娠,分娩および哺育などの生理的な負荷に加えて被験物質の影響を受けたことにより生じた二次的変化である可能性が考えられる.なお,200 mg/kg群の胸腺退縮を示した動物および非分娩動物で肉眼的に観察された副腎の白色化については病理組織変化が認められず,毒性学的意義は不明であった.また,投与直後の一過性の流涎が200 mg/kg群の雌雄で観察されたが,単回皮下投与試験で大量投与した場合には流涎は発現していないことから2),被験物質の局所刺激性に起因したものであると考えられる.
新生児の検査において, 200 mg/kg群で低体重および生後の体重増加抑制の傾向が認められ,被験物質の次世代発育への影響が示唆された.しかし,出産児数,出産生児数,性比,出生率および新生児生存率には被験物質の影響は認められなかった.また,外表,一般状態および剖検においても異常は認められなかった.したがって, 被験物質の次世代に対する影響は比較的軽度なものと推察される.
被験物質は外因性 gonadotropinによる幼若ラット子宮重量の増加作用を増強することから10),内分泌系あるいは生殖器系への影響が示唆されている.しかし,本試験においては最高用量の200 mg/kg群でも生殖機能および分娩,哺育に対する影響は認められなかった.また,鶏卵胚を用いた試験では四肢,眼,顎骨などの複��株)��`を発現することが報告されているが11),ラットを用いた本試験においては催奇形性を示唆する変化は認められなかった.
以上のように,本試験では反復投与による影響として,親動物には 40 mg/kg以上の群で,雌雄ともに前胃の病理変化,さらに200 mg/kg群では雄で体重増加抑制の傾向および死亡,雌で自発運動減少および歩行失調などの投与後症状が認められた.生殖・発生に及ぼす影響として,親動物の生殖機能および分娩,哺育機能には影響が認められなかったが,200 mg/kg群で新生児の発育への影響を示唆する変化が認められた.したがって,本試験条件下における反復投与毒性に関する無影響量は雌雄とも8 mg/kg/day, 生殖発生毒性に関する無影響量は親動物に対して雌雄とも200 mg/kg/day,児動物に対しては40 mg/kg/dayと考えられる.
| 1) | P. M. Jenner et al., Food Cosmet. Toxicol., 2, 327 (1964). |
| 2) | 井関元八,大阪市立大学医学誌, 5, 111(1956). |
| 3) | R. James and J. B. Glen, J. Med. Chem., 23, 1350 (1980). |
| 4) | C. W. Flickinger, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 37, 596 (1976). |
| 5) | B. J. Dean, Mut. Res., 47, 75(1978). |
| 6) | E. F. Davis et al., "Handbook of toxicology," ed by D. S. Dittmer, W. B. Saunders Company, Philadelphia and London, 1959, pp.172-173. |
| 7) | A. Manabe et al., Japan. J. Pharmacol., 44, 77(1987). |
| 8) | D. L. J. Opdyke, Food Cosmet. Toxicol., 17, 743 (1979). |
| 9) | P. Greaves, "Histopathology of preclinical toxicity studies," Elsevier, Amsterdam, 1990, pp.112-114. |
| 10) | A. B. Kar et al., J. Sci. Industr. Res., 19C, 264(1960). |
| 11) | M. J. Verrett et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 56, 265(1980). |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 松浦郁夫 | ||
| 試験担当者: | 田谷ゆかり,土谷 稔,涌生ゆみ,豊田直人,高野克代 | ||
| (株)三菱化学安全科学研究所鹿島研究所 | |||
| 〒 314-02 茨城県鹿島郡波崎町砂山14 | |||
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| Authors: | Ikuo Matsuura(Study director) Yukari Taya, Minoru Tsuchitani, Yumi Wako, Naoto Toyota, Katsuyo Takano | ||
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