検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA15371) および Escherichia coli WP2 uvrA2) を用い，S9 Mix 無添加および添加試験のいずれも用量設定試験を，50〜5000 μg/プレート の用量で行ったところ，抗菌性が認められたことから，本試験は最低用量を 39.06〜156.3 μg/プレート，最高用量を 1250〜5000 μg/プレート として実施した．
その結果，2回行った本試験において，TA100 の S9 Mix 無添加および添加試験およびTA1535 の S9 Mix 無添加で，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加が認められたことから，1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは，用いた試験系において変異原性を有する（陽性）と判定された．
S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames 博士から分与を受けた．E. coli WP2 uvrA 株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．検定菌は，-80℃以下で凍結保存した．各検定菌は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異（rfa）とアンピシリン耐性因子（pKM101）の有無についての特性確認を行った．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2（Oxoid）を入れたL字型試験管に種菌を接種し，37℃，約10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンをジメチルスルホキシド（DMSO，和光純薬工業(株)）に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で更に公比2ないし約3で希釈したものを，速やかに試験に用いた．
DMSO 溶液中での被験物質の安定性試験を低濃度（0.7813 mg/ml）および高濃度（50 mg/ml）の2濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後4時間における各3サンプルの平均含量は，それぞれ初期値（0時間) の平均に対して，98.9および 99.6%であった．また，本試験IIに用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，0.7813 mg/ml 溶液の含量は既定濃度に対し，105〜107%，50 mg/ml 溶液は96.9〜99.5%であった．以上の結果から，1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは DMSO 溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．
| AF2 | ： | フリルフラマイド | （上野製薬(株)） |
| SA | ： | アジ化ナトリウム | （和光純薬工業(株)） |
| 9AA | ： | 9-アミノアクリジン | （Sigma Chem.Co.） |
| 2AA | ： | 2-アミノアントラセン | （和光純薬工業(株)） |
AF2, 2AA は DMSO（和光純薬工業(株)）に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AA は DMSO に，SA は蒸留水に溶解し，速やかに試験に用いた．
| (A) | バクトアガー (Difco) 塩化ナトリウム | 0.6％ 0.5％ |
| (B) | * L-ヒスチジン ビオチン | 0.5 mM 0.5 mM |
| * ： | WP2 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた． |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66ｇ |
| クエン酸・1水和物 | 2ｇ |
| グルコース | 20g |
| リン酸水素二カリウム | 10g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92g |
| バクト・アガー (Difco) | 15g |
| **S9 | 0.1 ml |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液 (pH 7.4) | 100 μmol |
| ** ： | 7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製した S9 (キッコーマン(株)）を用いた． |
小試験管中に被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml（S9 Mix 添加試験においては S9 Mix 0.5 ml），検定菌液 0.1 ml およびトップアガー2 ml，を混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに DMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTable1〜2に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．
この結果から，本試験における最高用量を 2500 または 5000 μg/プレート とした．しかし，1回目の本試験では抗菌性のない用量が4用量に達しない検定菌があったため，用量を下げて再度試験を行った．その結果においても，TA1535 と TA1537 の S9 Mix 無添加試験では抗菌性のない用量が4用量に達しなかったため，さらに用量を下げて試験を行った．
以上の結果に基づき，1,4-ジクロロ-2-ニトロベンゼンは，用いた試験系において変異原性を有する（陽性）と判定した．
| 1) | D.M. Maron, B.N. Ames, Mutation Research, 113, 173 -215 (1983). |
| 2) | M.H.L. Green, in "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, (eds.) Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 原 巧，坂本京子，加藤基恵， 堀谷尚古，川上久美子，松木容彦， 飯田さやか，中込まどか | ||
| （財）食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
| 〒257 神奈川県秦野市落合 729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | |||
| Authors: | Tohru Shibuya (Study Director) Takumi Hara, Kyoko Sakamoto, Motoe Katoh, Naoko Horiya, Kumiko Kawakami, Yasuhiko Matsuki, Sayaka Iida and Madoka Nakagomi | ||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | |||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257, Japan | |||
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | ||