2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノールについて，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いる復帰変異試験を実施した．
用量設定試験の結果をもとに，本試験ではS9 mix無添加および添加の場合とも，菌の生育阻害を示さないと考えられる濃度が4濃度以上含まれるように公比2で6濃度，すなわち，TA100，TA1535，TA98，TA1537では，9.77，19.5，39.1，78.1，156.3，312.5 μg/plate，WP2 uvrAでは，39.1，78.1，156.3，312.5，625，1250 μg/plateとした．
2回の本試験の結果，S9 mix無添加および添加のいずれの濃度においても，復帰変異コロニー数が陰性対照の2倍以上に増加しなかった．
以上の結果から，本試験条件下において2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノールは変異原性を有しない(陰性)と結論する．
2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノール(ロット番号 : RWN9641，和光純薬工業(大阪))は，黄色の塊，溶解時は黄色の液体で水に不溶，純度:96.0 %である．被験物質は冷蔵で保管した．被験物質はジメチルスルホキシド(以下DMSO，同仁化学研究所)に用時溶解して最高濃度原液を調製し，その後，DMSOで順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を調製した．
陽性対照物質として下記のものを用いた．
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(Sigma-Aldrich) |
| NaN3 | : | アジ化ナトリウム(ナカライテスク) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(ナカライテスク) |
| AF-2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業) |
NaN3は注射用水(大塚製薬工場)に，その他はDMSOに溶解したものを使用した．
Salmonella typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA15371)およびEscherichia coli WP2uvrA2)の5菌株を用いた．これら5菌株は，日本バイオアッセイ研究センターから分与された．試験菌株は，超低温フリーザー(-80℃)で凍結保存したものを使用した．これら菌株はアミノ酸要求性，紫外線感受性，膜変異，薬剤耐性などの遺伝的特徴を事前に調べ，特性を備えていることを確認した．
試験に際して，L字型試験管にニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2)溶液を10 mL分注し，これに凍結保存した菌懸濁液を融解して20 μLを接種した．37℃で8時間振盪培養した後，濁度計を用いて濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式から1 mLあたりの生菌数が1×10^9以上であることを確認した．
注射用水100 mLに対して，Bacto Agar(DIFCO)0.6 g，塩化ナトリウム0.5 gの割合で加え，高圧蒸気滅菌し完全に溶解させた後，S. typhimuriumの場合には0.5 mmol/L L-ヒスチジンと0.5 mmol/L D-ビオチンを混合した水溶液を，E.coliの場合には0.5 mmol/L L-トリプトファン水溶液を10:1の割合で加えて調製した．
テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業)を購入し，使用した．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
| 硫酸マグネシウム・七水塩 | 0.2 g |
| クエン酸・一水塩 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 寒天 | 15 g |
培地は，径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
S9(オリエンタル酵母工業)は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製され，製造後6ヵ月以内のものを用いた．S9 mixは，S9 mix用のCofactor(Cofactor-�機ぅ�リエンタル酵母工業)を注射用水で溶解して，使用直前にS9 を加えて調製した．
S9 mix 1 mLあたりの組成は下記のとおりである．
| S9 | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム六水塩 | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| D-グルコース6-リン酸 | 5 μmol |
| b-NADPH | 4 μmol |
| b-NADH 4 | μmol |
| Na-リン酸緩衝液(pH7.4) | 100 μmol |
| 注射用水 | 残量 |
試験はプレインキュベーション法で実施した．
乾熱滅菌した試験管に�“鏝格�質調製液，陰性対照液，陽性対照液0.1 mL，��0.1 mol/L Na-リン酸緩衝液(pH7.4)0.5 mL(S9 mix無添加)またはS9 mix 0.5 mL(S9 mix添加)，�６欸�濁液0.1 mLの順に加え，37℃で20分間振盪培養した．その後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加え混和し，最少グルコース寒天平板培地上に播き広げ，トップアガーが凝固した後，プレートを転倒して37℃で48時間培養した．
培養終了後，被験物質による菌の生育阻害を調べるため，実体顕微鏡(×100)を用いて菌の生育状態を観察した．また，目視により被験物質の析出の有無を確認した．復帰変異コロニー数は，自動コロニーカウンターにより計測した．用量設定試験は各濃度につき1枚のプレートを使用した．本試験は各濃度につき3枚のプレートを使用し，再現性を確認するため2回実施した．
被験物質における復帰変異コロニー数が，陰性(溶媒)対照の2倍以上の値を示し，濃度に依存して増加し，さらにその増加に再現性が認められた場合に，変異原性を有する(陽性)と判定した．なお，結果の判定には統計学的手法は用いなかった．
用量設定試験を1.22，4.88，19.5，78.1，312.5，1250，5000 μg/plateの7濃度で実施した結果，S9 mix無添加および添加の場合とも，TA100，TA1535，TA98，TA1537では312.5 μg/plate以上の濃度において，
WP2 uvrAでは1250 μg/plate以上の濃度において菌の生育阻害が認められた．なお，S9 mix無添加および添加の場合とも，析出物は認められなかった．従って，本試験ではS9 mix無添加および添加の場合とも，TA100，TA1535，TA98，TA1537では，9.77，19.5，39.1，78.1，156.3，312.5 μg/plate，WP2 uvrAでは，39.1，78.1，156.3，312.5，625，1250 μg/plateの6濃度を設定した．
2回の本試験の結果，S9 mix無添加および添加の場合とも，いずれの菌株においても，陰性対照値の2倍以上を示す復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
S9 mix無添加および添加の場合とも，すべての濃度において析出は認められなかった．
なお，S9 mix無添加および添加において陽性対照が各菌株に誘発した復帰変異コロニー数は，各菌株の陰性対照の復帰変異コロニー数と比較して，明らかに2倍以上に増加し，陽性結果を示した．
以上の結果から，本試験条件下において2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノールは変異原性を有しない(陰性)と結論する．
なお，2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノールは当試験施設で同時期に実施した哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験で陰性の結果が得られている3)．また，関連物質の2,4-ジニトロフェノールでは復帰変異試験において疑陽性，染色体異常試験において陽性との報告がある4,5)．
| 1) | Maron DM, Ames BN:Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res, 113:173-215(1983)． |
| 2) | Green MHL, Muriel WJ:Mutagen testing using Trp+ reversion in Escherichia coli. Mutation Res, 38:3-32(1976)． |
| 3) | 三輪芳久ら:2-sec-ブチル-4,6-ジニトロフェノールの哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験．化学物質毒性試験報告，12:105-108(2005)． |
| 4) | 野田篤ら:2,4-ジニトロフェノールの細菌を用いる復帰変異試験．化学物質毒性試験報告，8:27-32 (2001)． |
| 5) | 野田篤ら:2,4-ジニトロフェノールのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験．化学物質毒性試験報告，8:33-36(2001)． |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 三輪芳久 | ||
| 試験担当者: | 永澤佳子，小林梨沙 | ||
| �蠧�本バイオリサーチセンター羽島研究所 | |||
| 〒501-6251 岐阜県羽島市福寿町間島6-104 | |||
| Tel 058-392-6222 | Fax 058-392-1284 | ||
| Correspondence | |||
| Authors: | Yoshihisa Miwa(Study director) Yoshiko Nagasawa, Risa Kobayashi | ||
| Nihon Bioresearch Inc. | |||
| 104, 6-chome, Majima, Fukuju-cho, Hashima, Gifu, 501-6251, Japan. | |||
| Tel +81-58-392-6222 | Fax +81-58-392-1284 | ||
