試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEsherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．
20〜5000 μg/plateの範囲で行った濃度設定試験においては，S. typhimuriumでは，直接法および代謝活性化法ともに100 μg/plate以上で，また，E. coliでは直接法の場合は100 μg/plate以上，代謝活性化法の場合は200 μg/plate以上で，菌の生育阻害が認められた．したがって，本試験は，6.25〜200 μg/plateの範囲の濃度(公比2)を用いて行った．
試験を2回行った結果，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において復帰変異コロニー数の明らかな増加は認められなかった．菌の生育阻害については，濃度設定試験の結果と同様の濃度で認められた．
以上の成績から，6-tert-ブチル-m-クレゾールの細菌に対する遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．
試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その30 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated, Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37℃で12時間振盪培養した．培養後の懸濁菌液は濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1×109以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．
各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．
実験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
| AF-2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル) アクリルアミド(和光純薬工業(株)) |
| 2-AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
| NaN3 | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9-AA | : | 9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.) |
AF-2および2-AAはDMSO(和光純薬工業(株))に，NaN3および9-AAは蒸留水((株)大塚製薬工場)に溶解した．
| 硫酸マグネシウム・七水塩 | 0.2 g |
| クエン酸・一水塩 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 寒天(OXOID Agar No. 1) | 15 g |
試験管に使用溶媒，被験物質供試液あるいは陽性対照物質溶液を0.1 mL入れ，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL ，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，濃度設定試験では各濃度とも1枚，本試験では3枚を使用した．本試験は，同一濃度を用いて2回行った．
| 1) | 被験物質処理群において溶媒対照値の2倍以上の復帰変異コロニー数が出現する． |
| 2) | 被験物質濃度の増加とともに復帰変異コロニー数が増加する(濃度依存性)． |
| 3) | 2回にわたる本試験の結果から，復帰変異コロニー数の増加に再現性が認められる． |
試験を2回行った結果(Tables 1〜4)，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株において復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えることはなかった．また，菌の生育阻害は濃度設定試験の結果と同様の濃度で認められた．
以上の成績から，本実験条件下では，6-tert-ブチル-m-クレゾールの遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．
6-tert-ブチル-m-クレゾールの類縁化合物である4-tert-ブチルフェノール3, 4)，2-sec-ブチルフェノール5, 6)， 4-sec-ブチルフェノール7)，2,6-ジ-tert-ブチルフェノール3)，2,4,6-トリ-tert-ブチルフェノール8)，4,4'-チオビス(6-tert-ブチル-m-クレゾール)および2,2'-メチレンビス(6-tert-ブチル-ρ-クレゾール)4)は，いずれもS. typhimuriumおよびE. coli，またはS. typhimuriumを用いた復帰変異試験で陰性と報告されている．また，4-tert-ブチルフェノールおよび2,6-ジ-tert-ブチルフェノールにおいては酵母を用いた遺伝子突然変異試験でも陰性3)と報告されており，これら類縁化合物の試験結果も考え合せると6-tert-ブチル-m-クレゾールのin vitroにおける遺伝子突然変異誘発性は低いものと判断される．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983) |
| 2) | M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," 1, Vol. 3, eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187. |
| 3) | B. J. Dean, T. M. Brooks, G. Hadson-Walker, D. H. Hutson, Mutat. Res., 153, 57(1985). |
| 4) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 4，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1996. |
| 5) | K. Mortelmans, S. Haworth, T. Lawlor, W. Speck, B. Tainer, E. Zeiger, Environ. Mutagen., 8(suppl.7), 1(1986). |
| 6) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 7，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1999, p. 227. |
| 7) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 2，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1995, p. 343. |
| 8) | 石館 基監修，"微生物を用いる変異原性試験データ集，"エル・アイ・シー，東京，1991, pp. 560-561. |
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| 試験責任者： | 野田 篤 | ||
| 試験担当者： | 野田 篤，昆 尚美 | ||
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