o-トルエンスルホンアミドのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of o-Toluenesulfonamide in Rats

要約

o-トルエンスルホンアミドの28日間反復経口投与毒性試験(回復14日間)を雌雄のSprague-Dawley系ラットを用いて実施した．雌雄とも4群構成とし，1群には媒体である0.5 % CMC Na水溶液を，他の3群には被験物質を，それぞれ4，20および100 mg/kgの用量で28日間にわたり強制経口投与した．動物数は，雌雄とも対照群および100 mg/kg投与群では回復試験を行う動物も含め各10匹，その他の群は各5匹とした．

投与期間および回復試験期間中に死亡例はなく，一般状態の変化としては，100 mg/kg投与群の雌雄で，投与第2週から投与期間を通して流涎が観察され，活動性が低下した．さらに同群の雄1例では腹臥位姿勢も観察された．

病理組織学検査では，投与期間および回復試験期間終了時剖検例ともに，100 mg/kg投与群の雄で尿細管上皮のeosinophilic bodyが増加する傾向にあった．

この他，100 mg/kg投与群の雌では，投与期間終了週の尿検査でpHが高い傾向にあったが，被験物質投与に起因した変化であるか否かは明らかではなかった．

以上のことから，o-トルエンスルホンアミドを反復投与することにより，100 mg/kgの用量では雌雄で，投与後に流涎および活動性の低下が観察され，同群の雄で尿細管上皮のeosinophilic bodyの増加が認められることが明らかとなった．従って，本試験条件下におけるo-トルエンスルホンアミドの無影響量は，雌雄とも20 mg/kg/dayであると考えられた．

方法

1.　被験物質および投与検体の調製法

被験物質には，富士アミドケミカル(株)(東京)より提供されたo-トルエンスルホンアミド(ロット番号CHC1-7，純度99.95 wt%)を使用し，入手後，試験開始まで室温で保管した．なお，試験期間中の被験物質の安定性は，提供前および返却後(試験終了後)の被験物質の品質試験を提供元で実施することにより確認した．

被験物質を各用量毎に秤量し，所定濃度となるように媒体を加えて攪拌・懸濁して投与検体を調製した．媒体としては，カルボキシメチルセルロースナトリウム(日本薬局方カルメロースナトリウム，ロット番号6Z09，丸石製薬(株))を0.5 w/v%の濃度となるように，注射用水(製造番号9707SA，光製薬(株))に溶解したものを用いた．

なお，投与検体は，8日間の安定性が確認されているため1週間に1度の頻度で調製し，使用時まで気密，冷蔵の条件で保管した．また，各濃度の投与検体の含量測定および均一性試験結果から，投与検体中には所定濃度のo-トルエンスルホンアミドが含有され，均一性も良好であることが確認された．

2.　動物および飼育方法

試験には，生後4週で購入し，検疫と馴化を兼ねて8日間予備飼育した雌雄のSprague-Dawley系ラット[Crj:CD(SD)IGS，SPF，日本チャールス・リバー(株),]各30匹を使用した．

群分けは，検疫期間中に異常がなかった動物を用い，投与開始日前日の体重に基づいて体重別層化無作為抽出法により行った．各群の動物数は，雌雄とも対照群および高用量群を各10匹とし，低および中用量群を各5匹とした．

動物は，温度23〜25 ℃，湿度 50〜65 %，換気回数約15回/時および照明12時間(7〜19時点灯)に設定された飼育室内で，金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(CE-2，日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水)を自由摂取させて飼育した．

3.　投与量の設定および投与方法

本試験の投与量は，先に実施された反復経口投与毒性・生殖発生毒性併合試験1)(投与量0，20，100および500 mg/kg)の結果に基づき決定した．すなわち，o-トルエンスルホンアミドを雄で42日間，雌で交配前2週間，妊娠期間および分娩後3日間反復投与することにより，雄ではすべての被験物質投与群において，腎臓のeosinophilic bodyの形成が増強され，アルカリフォスファターゼ活性が低下した．雌では，100 mg/kg以上を投与することにより，自発運動の低下など一般状態の悪化が認められ，体重増加および摂餌量が抑制され，肝臓の相対重量が増加して小葉中心性の肝細胞肥大が認められた．また，500 mg/kg投与群では，13例中5例が死亡ないし瀕死状態による切迫屠殺となった．以上のことから，明らかな毒性変化が認められた100 mg/kgを本試験の最高用量とし，以下公比5で除して20および4 mg/kgを中および低用量とした．また，雌雄とも媒体である0.5 % CMC Na水溶液を投与する対照群を設けた．

投与経路は経口とし，1日1回，28日間，ラット用胃管を用いて強制的に投与した．投与容量は5 mL/kgとし，雌雄とも最近時の体重をもとに個体別に投与液量(mL)を算出した．なお，回復期間は14日間とした．

4.　観察および検査

1)　一般検査

毎日(投与期間中は投与前および投与後)全例の一般状態を観察した．また，体重は1週に2回の頻度で測定し，その他，投与期間終了日，回復試験期間終了日および剖検日にも測定した．摂餌量は毎週1回の頻度で測定した．

2)　尿検査

各群とも全例について，投与第4週および回復試験期間終了週に動物を代謝ケージに収容して蓄尿し，約4および24時間の時点で採尿した．この4時間尿を用いて試験紙法(クリニテック200+，バイエル・三共(株))によりpH，潜血，蛋白，糖，ケトン体，ウロビリノーゲンおよびビリルビンを，光学顕微鏡により沈渣を，視診により色調および混濁度を検査し，24時間尿を用いて尿量(天秤で重量を計測し，比重で除す)および比重(単位体積あたりの重量を測定)を検査した．

3)　血液学検査

投与期間ないし回復試験期間終了日から翌日の剖検日にかけて定期解剖例全例を18から24時間絶食させ，ペントバルビタールナトリウム麻酔下で，腹部後大静脈から抗凝固剤としてEDTA-3Kを用いて採血し，血液自動分析装置(CELL-DYN3500SL，ダイナボット(株))により赤血球数，平均赤血球容積，血小板数(以上，電気抵抗法)，白血球数(フローサイトメトリー・レーザー光散乱法/電気抵抗法)，白血球分類(フローサイトメトリー・レーザー光散乱法)および血色素量(吸光度法)を測定し，これらを基にヘマトクリット値，平均赤血球血色素量および平均赤血球血色素濃度を算出した．また，クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として採血して得られた血漿について，全自動血液凝固測定装置(CA-1000，東亜医用電子(株))を用いて，プロトロンビン時間および活性部分トロンボプラスチン時間(いずれも光散乱検出法)を測定した．

4)　血液生化学検査

血液学検査用の採血に引き続き，ヘパリンを抗凝固剤として採血して得られた血漿について，遠心方式生化学自動分析装置(COBAS-FARA，ロシュ・ダイアグノスティックス(株))を用いて総蛋白濃度(ビウレット法)，アルブミン濃度(BCG法)，総コレステロール濃度(COD・DAOS法)，ブトウ糖濃度(グルコキナーゼG6PDH法)，尿素窒素濃度(ウレアーゼGr．DH法)，クレアチニン濃度(Jaffe'法，Rate)，ALP活性(GSCC法)，GOT活性(IFCC法)，GPT活性(IFCC法)，γ-GTP活性(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド基質法)，トリグリセライド濃度(GPO・DAOS法)，総ビリルビン濃度(Jendrassik/Grof法)，無機リン濃度(モリブデン酸直接法)およびカルシウム濃度(OCPC法)を測定し，A/G比を算出した．また，全自動電解質分析装置(EA05，(株)A&T)により，ナトリウム濃度，カリウム濃度および塩素濃度(いずれもイオン電極法)を測定した．

5)　病理学検査

採血に引き続き，必要に応じて腋窩動脈を切断して放血屠殺した後，器官および組織を肉眼的に観察した．また，各動物の脳，心臓，肝臓，腎臓，胸腺，脾臓，副腎，精巣，精巣上体，卵巣，甲状腺，下垂体の重量を測定し，各器官重量を剖検日の体重で除してそれぞれの相対重量を算出した．ただし，甲状腺は0.1 mol/Lリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液中で24時間固定した後，気管から分離し，重量を測定した．さらに，脳，下垂体，脊髄，眼球，甲状腺，上皮小体，心臓，気管，気管支，肺，肝臓，腎臓，胸腺，脾臓，副腎，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，前立腺，精嚢，卵巣，子宮，腟，乳腺，膀胱，下顎リンパ節，腸間膜リンパ節，骨格筋(下腿部)，坐骨神経，大腿骨骨髄，膵臓，顎下腺，舌下腺，舌，食道，大動脈，ハーダー腺，皮膚および病変部を0.1 mol/Lリン酸緩衝10 %ホルマリン溶液に，精巣，精巣上体をブアン液に固定した後，投与期間終了時の全例および全ての病変部をパラフィン包埋して薄切し，ヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製した．その後，光学顕微鏡を用いて，対照群および高用量群の標本(病変部は全群)を組織学的に検査し，次いで，腎臓および脾臓については，この他の群でも組織学検査を行った．

5.　データ解析法

体重，摂餌量，半定量検査を除く尿検査ならびに定期解剖例の血液学検査，生化学検査の値および器官重量は，群ごとに平均値および標準偏差を求めた．また，試験群が3群以上あった場合は，Bartlettの方法による分散の一様性の検定，一元配置型の分散分析ないしKruskal-Wallisの順位検定およびDunnettないしDunnett型の検定法で多重比較を行った．2群の場合には，F-検定を行い，Studentのt検定法ないしAspin-Welchのt検定法を用いて有意差検定を行った．その他，尿の半定量的検査成績については，2×2の分割表を用いるχ2検定を行った．病理組織学検査所見のグレード分けしたデータは，Mann-WhitneyのU検定(両側検定)を陽性グレードの合計値はFisherの直接確率片側検定を行った．なお，これら対照群および被験物質投与群との間の有意差検定はいずれの場合も有意水準を5%とした．

結果

1.　死亡例

投与期間および回復試験期間中に死亡例はなかった．

2.　一般状態

100 mg/kg投与群では，雄で投与第7日以降，雌で投与第9日以降に流涎が観察され，雄で投与第9日以降，雌で10日以降に投与期間を通して活動性が低下した．流涎は，雌雄とも投与後15分未満の観察では認められず15分以上経過してから発現し，遅い場合でも投与後約2時間半には消失が確認された．活動性の低下は，雄で投与後15分以降，雌で投与後20分以降に現れ始め，いずれも最長でも投与後2時間10分には回復が確認された．さらに，100 mg/kg投与群では，雄1例で投与第15日以降断続して腹臥位姿勢が観察された．この他には，回復試験期間も含めて各群とも一般状態の変化は観察されなかった．

3.　体重(Fig. 1-1, 1-2)

回復試験第4日から第11日の測定時に，100 mg/kg投与群の雌で，対照群と比較して有意な低値を示した．この他，観察期間中，被験物質投与群では，雌雄いずれにおいても対照群との間に体重の有意な差は認められなかった．なお，雌の体重の低値は，投与期間中には認められない変化であり，雄の体重には変化が認められないことから被験物質投与による影響とは考えられない．

4.　摂餌量(Fig. 2)

100 mg/kg投与群の雌で投与第3週に，雄で回復試験第1週に対照群と比較して有意に減少した．この他，観察期間中，被験物質投与群では，雌雄とも対照群との間に有意差は認められなかった．なお，100 mg/kg投与群の雌で投与第3週に摂餌量が減少したが，同時期の体重には影響はみられなかった.

5.　尿検査所見(Table 1)

投与第4週の検査では，100 mg/kg投与群の雌でpHが高い傾向にあったが，雄では明瞭ではなかった．回復第2週の検査も含め，いずれの項目にも対照群と被験物質投与群の間に有意差はなかった．

6.　血液学検査所見(Table 2)

投与期間終了時の検査では，いずれの項目においても対照群と被験物質投与群との間に有意な変化はなかった．

回復試験期間終了時の検査では，100 mg/kg投与群の雄で，赤血球数が有意に減少し，平均赤血球容積および平均赤血球血色素量が有意に増加したが，このほかには対照群と比較して有意な変化はなかった．

7.　血液生化学検査所見(Table 3)

投与期間終了時の検査では，20 mg/kg投与群の雄および100 mg/kg投与群の雌で尿素窒素濃度が有意に上昇したが，この他には，いずれの検査項目においても対照群と被験物質投与群の間に有意差は認められなかった．

回復試験期間終了時の検査では，100 mg/kg投与群の雄で尿素窒素濃度が有意に上昇し，クレアチニン濃度およびGOT活性が有意に低下した．同群の雌では，アルブミン濃度，総コレステロール濃度，トリグリセライド濃度およびカルシウム濃度が有意に低下した．他の検査項目には対照群と被験物質投与群の間に有意な差は認められなかった．なお，投与期間終了時に20 mg/kg投与群の雄および100 mg/kg投与群の雌で，回復試験終了時には100 mg/kg投与群の雄で，それぞれ尿素窒素濃度が有意に上昇したが，この変化はより高用量を長期間投与した先の併合試験1)では認められておらず，雄では用量依存性もなかったことから，被験物質投与に起因した変化ではないと判断した．また，尿素窒素濃度以外の変化は，いずれも投与期間終了時には認められず，関連する検査項目にも変化はみられなかったことから，被験物質投与に起因した変化ではないと判断した．

8.　病理学検査所見

1)　器官重量(Table 4)

回復試験期間終了時の剖検では，100 mg/kg投与群の雄の脾臓の相対重量が有意に増加した以外には，投与期間終了時および回復試験期間終了時剖検とも対照群と被験物質投与群との間に有意差はなかった．

2)　肉眼所見

投与期間終了時解剖例では，精巣，精巣上体，精嚢および前立腺の小型化が4 mg/kg投与群の雄1例でみられたが，この他に雌雄各群とも変化は観察されなかった．

回復試験期間終了時解剖例では，胸腺の小型化が100 mg/kg投与群の雄1例に観察された以外に雌雄各群とも変化は観察されなかった．

3)　組織学検査所見(Table 5)

投与期間終了時解剖例では，100 mg/kg投与群の雄で尿細管上皮のeosinophilic bodyが増加する傾向にあったが，統計学的な有意差はなかった．この他，いくつかの器官で変化が散見されたが，いずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差は認められず，被験物質投与に起因した変化ではないと考えられた．なお，肉眼的に精巣等の小型化が観察された4 mg/kg投与群の雄1例は，精細管で精母細胞および精子細胞の変性がみられ，精巣上体管腔内の精子数が減少し，細胞残屑が認められたが，精嚢および前立腺に変化は見られなかった．今回認められた雄の生殖器および副生殖器の変化は，用量依存性のない変化であり，本被験物質の反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験1)において500 mg/kgを42日間反復投与した場合にも同様の変化は表れなかったことから，偶発的な異常であると判断した．

回復試験期間終了時解剖例では，投与期間終了時同様，100 mg/kg 投与群の雄で尿細管上皮におけるeosinophilic bodyの増加傾向を認めたが，以上の他には雌雄ともいずれの所見も群間でその発生頻度および程度に差はみられなかった．なお，肉眼的に小型化がみられた100 mg/kg投与群の雄の胸腺には組織学的な変化はなく，投与期間終了時剖検例では同様の変化は認められていないことおよび関連する検査項目に変化がみられなかったことから，偶発的な異常であると判断した．

考察

o-トルエンスルホンアミドを，4，20および100 mg/kgの用量で雌雄のSprague-Dawley系ラットに28日間にわたって強制経口投与し，その後14日間の回復試験期間を設けた．

100 mg/kg 投与群の雌雄では投与後15分を経過してから流涎および活動性の低下が観察され，雄においては1例ではあるが腹臥位姿勢もみられた．流涎や活動性の低下，腹臥位姿勢は本被験物質の反復投与毒性・生殖発生毒性併合試験1)においても認められており，被験物質投与に起因する変化であると考えられた．流涎は投与直後には観察されず，刺激性を有する物質を投与した場合にしばしば観察される消化管の変化2)も観察されなかったことから，被験物質の物理的影響によるものであるとは考え難い．作用発現時間から考察すると，流涎は被験物質による副交感神経刺激作用によるものである可能性も示唆されるが，一般的に副交感神経刺激時に流涎とともに観察されるといわれている縮瞳等の変化は認められなかった．

腎臓に関する所見として，100 mg/kg投与群の雄で近位尿細管上皮のeosinophilic bodyの増加，同群の雌で尿のpHの上昇が認められた．前者は，先の併合試験1)でも観察されていることから，被験物質投与に起因した変化であると考えられる．しかし，eosinophilic bodyは，近位尿細管上皮に取り込まれたa2u-グロブリンが，近位尿細管中間部上皮細胞のリソソーム内に取り込まれ，好酸性物質として観察される現象であるとされており3)，a2u-グロブリンは雄ラット固有の蛋白質であることから，今回の変化がヒトでの障害に直結するものではないと考えられる．100 mg/kg投与群の雄では，回復試験期間終了時剖検例でもeosinophilic bodyが増加する傾向にあったことから，投与中止による回復性は明らかなものではなかった．TSA投与により尿のアシドーシスが生じ，腎臓および膀胱において結石が形成されることが知られており，尿のアシドーシスを緩和する塩化アンモニウムを併用することにより，この結石形成が抑制されることが報告されている4)．しかし，100 mg/kg投与群の雌で認められた尿のpHの変化はアルカリに傾くものであったこと，また，アルカリ傾向についても個体差が大きく，同一個体の回復試験終了週と投与期間終了週の結果を比較しても，変化が一定の方向を示さなかったことから，被験物質投与との関連は明らかではなかった．

この他，100 mg/kg投与群の雄では，回復試験期間終了時の検査で，脾臓重量の増加，赤血球数の減少，平均赤血球容積および平均赤血球血色素量の増加が有意な変化となった．このうち平均赤血球血色素量の増加は，先の併合試験1)でも認められていることから，被験物質投与による影響であることを懸念し，貧血傾向と被験物質投与の関係について検討するため，本試験の雌雄全例について，脾臓の病理組織学的検査を実施した．その結果，全例で髄外造血および褐色色素の沈着がみられたが，所見の程度に各群間で差は認められず，本試験，併合試験のいずれも，赤血球系の他の検査項目には変化がみられないことから，脾臓重量ならびに血液学検査所見の有意差は，被験物質投与による変化ではないと判断した．

本試験の結果から，o-トルエンスルホンアミドを反復投与することにより，100 mg/kgの用量の雌雄で，投与後に流涎および活動性の低下が観察され，雄では尿細管上皮のeosinophilic bodyが増加することが明らかとなったことから，無影響量は雌雄とも20 mg/kg/dayであると推察された．

文献

1)代田眞理子，化学物質毒性試験報告書，7, 134(1999)．
2)J. R. Glaister,"毒性病理学の基礎,"高橋道人監訳，p.87，ソフトサイエンス社，東京，1992．
3)D. K. Curtis, "Toxic responses of the kidney in "Casarett and Doull's Toxicology-The basic science of poisons"," pp.417-442, McGraw Hill, New York, 1996.
4)D. L. Arnold, Toxicol. Appl. Pharmacol., 51, 455(1979).

連絡先
試験責任者：高島宏昌
試験担当者：森村智美，吉田弘道，加藤博康，関　剛幸，新藤智子，丸茂秀樹，堀内伸二，稲田浩子，三枝克彦，安生孝子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-76-8033Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Authors:Hiromasa Takashima(Study Director)
Tomomi Morimura, Hiromichi Yoshida, Hiroyasu Kato, Takayuki Seki, Shindo Tomoko, Hideki Marumo, Shinji Horiuchi, Hiroko Inada, Katsuhiko Saegusa, Takako Anjo
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627