2,6-ジメチルアニリンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．
試験菌株として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli (WP2 uvrA)の5菌株を用いた．用量設定試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において2.29〜5000 μg/plateの8用量，本試験ではS9 mix無添加群のTA100ならびにS9 mix添加群のTA100, TA1535およびTA1537で39.1〜2500 μg/plateの7用量，S9 mix無添加群のTA1535，S9 mix無添加群およびS9 mix添加群のWP2 uvrAならびにTA98で156〜5000 μg/plateの6用量で試験を実施した．
その結果，S9 mix添加群のTA100およびTA1535で復帰変異コロニー数に明確な増加が認められた．また，S9 mix添加群のTA100において，用量設定試験では溶媒対照の2倍以上に復帰変異コロニー数が増加したが，本試験では2倍以上の増加を示す用量が得られなかったため，273〜1300 μg/plateの8用量で確認試験を実施した．
その結果，1040 μg/plateにおいて復帰変異コロニー数の増加が認められた．用量設定試験，本試験ならびに確認試験により試験結果の再現性が確認されたことから陽性反応と判断した．
以上の結果より，本試験条件下では2,6-ジメチルアニリンは，変異原性を有する(陽性)と結論した．
細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA15371)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA2)の5種類の菌株を選択した．
ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のAmes BN教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成14年9月30日〜10月3日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．
各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO: MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．
塩化ナトリウム0.5 w/v%を含む0.6 w/v% Bacto- agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学)-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学)水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学)水溶液を同じく1容量加え用いた．
製造後6ヵ月以内のキッコーマン製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague- Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
| 成分 | S9 mix 1 mL中の量 |
| S9 | 0.1 mL |
| MgCl2 | 8 μmol |
| KCl | 33 μmol |
| G-6-P | 5 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| Na-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| 蒸留水 | 残量 |
被験物質の2,6-ジメチルアニリン(ロット番号: WAQ5400)は純度99.8 %の暗褐色澄明の液体である．本剤はDMSOに易溶である．和光純薬工業(静岡)から購入した被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温，遮光で保管した．試験終了後，被験物質購入元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
試験の都度，被験物質をモレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSOを用いて溶解し，調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．
2.29〜5000 μg/plateの8用量(公比3)を用いて用量設定試験を実施した．S9 mix添加群のTA100およびTA1535で用量に依存した復帰変異コロニー数の増加が認められ，溶媒対照値の2倍を超えていた．試験菌株に対する生育阻害作用はS9 mix無添加群の場合，TA100の1667 μg/plate以上，他の4菌株の5000 μg/plateで観察された．また，S9 mix添加群の場合はTA100, TA1535およびTA1537の1667 μg/plate以上，他の2菌株の5000 μg/plateで観察された．被験物質処理時およびコロニー計数時，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．
従って，本試験においてS9 mix添加群のTA100およびTA1535では，正確な用量反応曲線が得られる用量，すなわち2500 μg/plateを最高用量とし，それぞれ7用量(公比2)を設定した．他の菌株については，生育阻害作用が認められると考えられる用量，すなわち，S9 mix無添加群のTA100およびS9 mix添加群のTA1537において2500 μg/plateを最高用量とし，それぞれ7用量(公比2)，S9 mix無添加群のTA1535, WP2 uvrA，TA98およびTA1537ならびにS9 mix添加群のWP2 uvrAおよびTA98において5000 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．
また，S9 mix添加群のTA100において，用量設定試験では溶媒対照の2倍以上に復帰変異コロニー数が増加したが，復帰変異試験では2倍以上の増加を示す用量が得られなかったため確認試験を実施し，1300 μg/plateを最高用量とし， 8用量(公比1.25)を設定した．
陽性対照物質として下記に示した調製済み陽性対照物質溶液(オリエンタル酵母工業)を使用した．
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2)
アジ化ナトリウム(NaN3)
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA)
2-アミノアントラセン(2-AA)
Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/L ナトリウム・リン酸緩衝液(pH7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加し，さらに試験菌液100 μLを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス)を用いた．なお，生育阻害により，コロニーアナライザーの使用が不適切な場合，目視で計数した．各濃度につき3枚のプレートを使用した．
復帰変異コロニー数が溶媒対照の2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．なお，陽性と判定した菌株については，変異原性の強さの相対的比較値である比変異活性(比活性)を，当該濃度における誘発平均コロニー数([当該濃度での平均コロニー数]−[溶媒対照での平均コロニー数])を当該濃度値(mg)で除すことにより算出した．コロニー数の平均値は四捨五入する以前の値を用いた．
統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．
用量設定試験の結果をTable 1〜2に，本試験の結果をTable 3〜4に，確認試験の結果をTable 5に示した．用量設定試験では2,6-ジメチルアニリン処理により，S9 mix添加群，TA100の556 μg/plateおよびTA1535の1250 μg/plateで，それぞれ溶媒対照の2.4倍および3.7倍の復帰変異コロニー数が観察され，用量相関性も認められた．本試験ではS9 mix添加群，TA1535の1250 μg/plateで2,6-ジメチルアニリン処理により溶媒対照の3.0倍の復帰変異コロニー数が観察され，用量相関性も認められた．しかしながら，S9 mix添加群のTA100で復帰変異コロニー数の増加傾向が認められたが，陽性判定基準である溶媒対照の2倍を超えるものではなかった．したがって，S9 mix添加群のTA100での復帰変異コロニー数の増加傾向を確認するために確認試験を実施した結果，1040 μg/plateにおいて，溶媒対照の2.1倍の復帰変異コロニーが観察され，用量相関性も認められた．また，各試験において，試験菌株のいずれの処理群においても，試験菌株に対する生育阻害作用が高用量群で観察された．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰変異コロニーを誘発した．なお，被験物質処理時およびコロニー計数時，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．
以上の試験結果から，本試験条件下において，2,6-ジメチルアニリンの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陽性と判定した．
変異原性の強さに関する相対的比較値である比活性の最高値は232(用量設定試験，S9 mix添加群，TA100，556 μg/plate)と算出された．
なお，本被験物質(2,6-ジメチルアニリン)についてマウスを用いた小核試験で陰性3,4)，ラットあるいはマウスを用いたUDS試験で陰性5)との報告があった．また，ラットを用いた32P−ポストラベル試験で，DNA付加体の形成が確認され6)，BALB/c-3T3細胞を用いたトランスフォーメーション試験で陽性との報告7)があった．さらにNTPデータでは，本被験物質がラット(雌雄)の2年間発がん試験(混餌)で，鼻腔に明確な腫瘍の形成を誘発することが示され8)，また，遺伝毒性に関してはAmes試験では陰性もしくは弱い陽性，染色体異常試験では陽性，SCE試験では陽性，ショウジョウバエを用いた優性致死試験では陰性結果が示されていた9)．また，鼻腔に発がん性を示すことから，国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部のグループ(鈴木ら)がトランスジェニックマウスを用いて突然変異を検討したところ，鼻腔細胞でのみ突然変異の蓄積を認めている(データ未発表)．なお，本被験物質の代謝物であるN-ヒドロキシ-2,6-ジメチルアニリンについてAmes試験で陽性10)との報告があった．
類縁体である2,3-ジメチルアニリン，2,4-ジメチルアニリンおよび2,5-ジメチルアニリンについてAmes試験で陽性11)との報告があった．
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| 7) | Matthews EJ, Spalding JW, Tennant RW: Transformation of BALB/c-3T3 cells:IV. Rank-ordered potency of 24 chemical responses detected in a sensitive new assay procedure. Environ Health Perspect 101 Suppl 2:319- 345(1993)． |
| 8) | National Toxicology Program. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 278:1-138(1990)． |
| 9) | National Toxicology Program. 2,6-XYLIDINE. Available from URL: http://ntp.niehs.nih.gov/ index.cfm?objectid=071A7019-D98F-0BEA-F9 A168FA705384FF |
| 10) | Matilde Marques M, Gamboa da Costa G, Blankenship LR, Culp SJ, Beland FA:The effect of deuterium and fluorine substitution upon the mutagenicity of N-hydroxy-2,6-dimethylaniline. Mutation Res, 506-507:41-48(2002)． |
| 11) | Zimmer D, Mazurek J, Petzold G, Bhuyan BK: Bacterial mutagenicity and mammalian cell DNA damage by several substituted anilines. Mutation Res , 77:317-326(1980)． |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 益森勝志 | ||
| 試験担当者： | 田中 仁，永井美穂， 古屋有佳子，仲村渠奈美子， 菊池正憲 | ||
| 7食品農医薬品安全性評価センター | |||
| 〒437-1213 静岡県磐田郡福田町塩新田582-2 | |||
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | ||
| Correspondence | |||
| Authors: | Shoji Masumori(Study Director) Jin Tanaka, Miho Nagai, Yukako Furuya, Namiko Nakandakari, Masanori Kikuchi | ||
| Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center) | |||
| 582-2 Shioshinden , Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan | |||
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