被験物質投与に起因する死亡および一般状態の変化はみられなかった．
体重では，60 mg/kg群の雌および300 mg/kg群の雌雄で軽度な増加抑制が認められた．
摂餌量では，投与開始初期の一時的な減少が300 mg/kg群の雄に，尿検査では，pHの低下，ビリルビンおよび潜血の増加，尿沈渣中の赤血球および白血球の増加，摂水量および尿量の増加と尿比重の減少が300 mg/kg群の雌雄に，尿沈渣中の小円形上皮細胞の増加が300 mg/kg群の雄に，尿蛋白の増加が300 mg/kg群の雌にみられた．
血液学検査では，赤血球数，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値および平均赤血球血色素濃度の減少ならびにメトヘモグロビン，平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，網赤血球率および白血球数の増加が300 mg/kg群の雌雄に，ヘモグロビン量の減少が60 mg/kg群の雌雄に，赤血球数およびヘマトクリット値の減少とメトヘモグロビンの増加が60 mg/kg群の雌に，血液生化学検査では，総ビリルビン，尿素窒素およびカリウムの増加が300 mg/kg群の雌雄に，γ-GTP活性および間接ビリルビンの増加が300 mg/kg群の雄に，GPT活性，総コレステロールおよびリン脂質の増加が300 mg/kg群の雌にみられた．
病理学的検査では，脾臓，腎臓，肝臓および骨髄(大腿骨)に変化がみられた．脾臓では300 mg/kg群の雌雄で肉眼的な腫大および器官重量の増加がみられ，組織学的には雄の60 mg/kg以上および雌の12 mg/kg以上の投与群で赤脾髄のヘモジデリン沈着の増強，300 mg/kgの雌雄で髄外造血の亢進および雄でうっ血がみられた．腎臓では，300 mg/kg群の雌雄で器官重量の増加がみられ，組織学的には300 mg/kg群の雌雄で腎乳頭壊死および尿細管の拡張および皮質における間質の細胞浸潤がみられた．さらに，雄で尿細管の好塩基性変化および髄質内帯の鉱質沈着がみられ，尿細管上皮の好酸性小体の出現について変化の程度が増強していた．また，雌の300 mg/kg群および雄の60 mg/kg群では，硝子円柱がみられた．肝臓では，60 mg/kg群の雌および300 mg/kg群の雌雄で器官重量の増加がみられ，組織学的には300 mg/kg群の雌雄で小葉中心性の肝細胞肥大および胆管の増生，クッパー細胞のヘモジデリン沈着および髄外造血の亢進がみられた．骨髄(大腿骨)では，造血の亢進が60 mg/kg以上の投与群の雌雄でみられた．
休薬期間終了後には，腎臓の変化を除くほとんどの変化は消失または軽減傾向を示し，可逆性の変化と考えられた．
以上の結果から，本試験条件下における2,3-ジメチルアニリンの無影響量は雄では12 mg/kg/day，雌では12 mg/kg/dayを下回ると考えられた．
投与容量が5 ml/kg体重となるよう，オリーブ油(日本薬局方)に溶解して高用量群の投与液(6%(w/v))を調製した．中および低用量群の投与液は，6%液をオリーブ油で段階的に希釈してそれぞれ1.2および0.24%(w/v)液とした．0.1〜10%(w/v)液は，室温で1日間および冷蔵(約4℃)・遮光(褐色ガラス瓶)で8日間まで安定であったことから，被験液は最大1週間分を一括して調製し，1日分ずつ褐色ガラス瓶に分注し，冷蔵庫(約4℃)に保存した．また，投与開始前および投与終了週の2回，投与に使用する各濃度液について当施設で測定した結果，いずれも適正であった．
動物は，群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群の平均体重がほぼ均等となるよう，コンピュータを用いて各群に割り付けた．
動物は，温度23±3℃，相対湿度50±20%，換気回数1時間当たり10〜15回，照明1日12時間の飼育室で，金属製網ケージに1匹ずつ収容し，固型飼料(放射線滅菌CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))および飲料水(水道水)を自由に摂取させ飼育した．
被験液の投与容量は5 ml/kg体重とし，1日1回28日間強制経口投与した．対照群には溶媒(オリーブ油)を同様に投与した．投与液量は最新の体重を基準に算出した．回復期間は14日間とした．
法)，ナトリウム，カリウムおよび塩素(イオン選択電極法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(モリブデン酸法)，総蛋白質(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(総蛋白質およびアルブミンから算出)(以上自動分析装置Monarch，Instrumentation Laboratory)，総ビリルビン，直接ビリルビン(以上アルカリアゾビリルビン法，分光光度計UVIDEC-66，(株)日本分光メディカル)および間接ビリルビンを測定した．また，ヘパリンを加えた容器に採血し，遠心分離(3000 rpm，10分間)により得られた血漿を用いてGOT，GPT，LDH(UV-rate法)，γ-GTP(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド法)およびChE(DTNB法)(以上自動分析装置Monarch，Instrumentation Laboratory)を測定した．
脳，胸腺，甲状腺(上皮小体を含む)，心臓，肺(気管支を含む)，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，卵巣
脳，脊髄，坐骨神経，心臓，気管，肺(気管支を含む)，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，肝臓，膵臓，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，副腎，胸腺，脾臓，腸間膜リンパ節，頸部リンパ節，腎臓，膀胱，精巣，精巣上体，精嚢，前立腺，卵巣，子宮，腟，眼球，骨及び骨髄(胸骨・大腿骨)，肉眼的異常部位
雌では，各投与群の体重は対照群とほぼ同様に推移したが，60および300 mg/kg群では投与期間中の体重増加量が対照群に比べて有意に低かった．
雌では，300 mg/kg群で回復14日に対照群を有意に上回った．
雌では，60 mg/kg以上の投与群で赤血球数，ヘモグロビン量およびヘマトクリット値の有意な減少とメトヘモグロビンの有意な増加がみられ，300 mg/kg群では，上記の変化に加えて平均赤血球容積，平均赤血球血色素量，網赤血球率および白血球数の有意な増加と平均赤血球血色素濃度の減少傾向がみられた．
雌では，60 mg/kg以上の投与群で赤血球数の有意な減少が，300 mg/kg群ではこれに加えてヘモグロビン量，ヘマトクリット値，平均赤血球容積および平均赤血球血色素量の有意な増加がみられた．なお，網赤血球率の有意な増加が60 mg/kg群にみられたが，用量に関連した変化ではなかった．
雌では，300 mg/kg群でGPT活性，総コレステロール，リン脂質，総ビリルビンおよび尿素窒素の有意な増加とカリウムの増加傾向がみられた．
雌では，300 mg/kg群で総ビリルビンの有意な減少がみられた．
雌では，300 mg/kg群で摂水量および尿量の有意な増加と尿比重の減少傾向，pHの低下傾向と尿蛋白，潜血およびビリルビンの増加傾向ならびに尿沈渣中の赤血球および白血球の増加傾向がみられた．
雌では，各投与群とも被験物質投与による変化はみられなかった．
雌では，300 mg/kg群で肝臓，脾臓ならびに腎臓の絶対および相対重量の有意な増加，60 mg/kg以上の投与群で甲状腺の絶対および相対重量の有意な増加がみられ，相対重量の有意な増加は12 mg/kg群にもみられた．
その他として，脳の絶対および相対重量の有意な増加が60 mg/kg群の雌に，卵巣の絶対重量の有意な減少が12および300 mg/kg群にみられたが，いずれも用量に関連した変化ではなかった．
その他として，脾臓の相対重量の有意な増加が60 mg/kg群の雄にみられたが用量に関連した変化ではなかった．
肝臓:小葉中心性の肝細胞のごく軽度な肥大が300 mg/kg群の雌雄全例に，ごく軽度な髄外造血亢進が300 mg/kg群の雌雄各4例に，ごく軽度または軽度な胆管増生が300 mg/kg群の雄1例と雌4例に，クッパー細胞のごく軽度なヘモジデリン沈着が300 mg/kg群の雄1例と雌3例にみられた．
脾臓:赤脾髄のヘモジデリン沈着が，雄では対照群および12 mg/kg群において全例がごく軽度なのに対し，60 mg/kg群ではごく軽度および軽度が各3例，300 mg/kg群では全例が軽度，また，雌では対照群において全例が軽度なのに対し，12 mg/kg群では軽度が1例と中等度が5例，60 mg/kg群では全例が中等度，300 mg/kg群では軽度が2例と中等度が4例であり，雄の60 mg/kg以上および雌の12 mg/kg以上の投与群でヘモジデリン沈着の増強が認められ，雄の300 mg/kg群および雌の12 mg/kg以上の投与群では統計学的有意差も認められた．また，髄外造血亢進は，対照群および60 mg/kg以下の投与群の雌雄全例ではごく軽度なのに対し，300 mg/kg群の雌雄全例では軽度であり，300 mg/kg群の雌雄で髄外造血亢進の増強がみられた．他に，ごく軽度なうっ血が300 mg/kg群の雄全例にみられた．
腎臓:ごく軽度または軽度な乳頭壊死が300 mg/kg群の雄3例と雌全例に，尿細管のごく軽度または軽度な拡張が300 mg/kg群の雄2例と雌3例に，ごく軽度な硝子円柱が60 mg/kg群の雄1例と300 mg/kg群の雌3例に，皮質における軽度な間質の細胞浸潤が300 mg/kg群の雌雄各1例に，尿細管のごく軽度な好塩基性化およびごく軽度な髄質内帯の鉱質沈着が300 mg/kg群の雄各1例にみられた．また，ごく軽度または軽度な尿細管上皮の好酸性小体の出現が対照群，12および60 mg/kg群の雄の各4例と300 mg/kg群の雄全例にみられたが，300 mg/kg群では統計学的有意差がみられ，変化の程度の増強がみられた．
骨髄(大腿骨):ごく軽度または軽度な造血亢進が，60 mg/kg群の雄1例と雌2例，300 mg/kg群の雌雄全例にみられた．
上記以外の所見は出現状況とその病理学的性状からいずれも偶発所見と判断した．
肝臓:ごく軽度な胆管増生が300 mg/kg群の雌3例にみられた．他に，ごく軽度または軽度な小葉周辺部の肝細胞の脂肪化が，対照群を含む雌雄各群にみられたが生理的変化であった．
脾臓:赤脾髄のヘモジデリン沈着が，雄では対照群および60 mg/kg群において全例が軽度なのに対し，300 mg/kg群では全例が中等度，また，雌では対照群において軽度および中等度が各3例なのに対し，60 mg/kg以上の投与群では全例が中等度であり，雄の300 mg/kgおよび雌の60 mg/kg以上の投与群でヘモジデリン沈着の増強が認められ，雄の300 mg/kg群では統計学的有意差もみられた．
腎臓:ごく軽度または軽度な乳頭壊死が300 mg/kg群の雄3例と雌4例に，尿細管のごく軽度な好塩基性化が300 mg/kg群の雄2例と雌1例に，髄質内帯のごく軽度な鉱質沈着が300 mg/kg群の雄2例に，皮質におけるごく軽度な間質の細胞浸潤が300 mg/kg群の雄3例にみられた．
骨髄(大腿骨):ごく軽度な造血亢進が，300 mg/kg群の雄1例と雌3例にみられた．
上記以外の所見は出現状況とその病理学的性状からいずれも偶発所見と判断した．
体重では，60 mg/kg群の雌と300 mg/kg群の雌雄で軽度な増加抑制が認められた．一方，摂餌量では，300 mg/kg群の雄で投与5日にごく軽度の減少がみられたのみであったことから，上記投与群では飼料効率の低下が示唆された．
尿検査では，300 mg/kg群の雌雄でpHの低下，ビリルビンの増加，尿沈渣中の赤血球および白血球の増加，摂水量および尿量の増加と尿比重の減少がみられ，これに加えて雄では尿沈渣中の小円形上皮細胞の増加，雌では潜血および尿蛋白の増加がみられた．ビリルビンの増加は本被験物質が芳香族アミン化合物であることからメトヘモグロビン血症に伴う溶血作用2)による変化，また，尿蛋白の増加，尿沈渣中の赤血球，白血球および小円形上皮細胞の増加ならびに摂水量および尿量の増加と尿比重の低下は，後述の腎臓障害に伴う所見と考えられた．
血液学検査では，60 mg/kg群の雌雄でヘモグロビン量の減少が，雌で赤血球数ならびにヘマトクリット値の減少およびメトヘモグロビンの増加がみられ，300 mg/kg群の雌雄ではこれに加えてMCHCの減少ならびにMCV，MCHおよび網赤血球率の増加がみられた．尿検査の項で述べた如く，本被験物質が属する芳香族アミン化合物はメトヘモグロビン血症を惹起することが知られており，芳香族アミン化合物に属する既存化学物質の毒性試験3-7)においてもメトヘモグロビン血症の発生が報告されていることから，本試験でみられた変化もメトヘモグロビン血症によるものと考えられた．また，300 mg/kg群の雌雄に白血球数の増加が認められたが，これは後述の腎臓における炎症性変化を反映したものと推察された．
血液生化学検査では，300 mg/kg群の雌雄で総ビリルビンおよびカリウムの増加，雄で間接ビリルビンの増加がみられ，メトヘモグロビン血症に起因した溶血作用の反映と考えられた．また，同用量群の雌雄でみられた尿素窒素の増加および雄でみられたγ-GTP活性の増加ならびに雌でみられたGPT活性の増加は，それぞれ被験物質の腎臓および肝臓に対する影響を示唆するものと考えられた．また，300 mg/kg群の雌でみられた総コレステロールおよびリン脂質の増加の原因は明らかでなかったが，肝障害の関連性が疑われた．
病理学的検査では，脾臓，腎臓，肝臓および骨髄(大腿骨)に変化がみられた．脾臓では300 mg/kg群の雌雄で肉眼的に腫大および器官重量の増加がみられ，組織学的には雄の60 mg/kg以上および雌の12 mg/kg以上の投与群で赤脾髄のヘモジデリン沈着の増強，300 mg/kg群の雌雄で髄外造血亢進および雄でうっ血がみられ，いずれもメトヘモグロビン血症に伴って脾臓における貪食作用が亢進し，また，貧血に対して代償性に造血が亢進した結果と考えられ，血液学検査所見とも一致する変化であった．
腎臓では，300 mg/kg群の雌雄で器官重量増加がみられ，組織学的には300 mg/kg群の雌雄で腎乳頭壊死，尿細管の拡張および皮質における間質の細胞浸潤，同用量群の雄で尿細管の好塩基性変化および髄質内帯の鉱質沈着と尿細管上皮の好酸性小体の出現の程度の増強が，雌で硝子円柱がみられ，腎臓が標的器官の一つと考えられた．
肝臓では，60 mg/kg以上の投与群の雌および300 mg/kg群の雄で器官重量が増加，組織学的には300 mg/kg群の雌雄で小葉中心性の肝細胞肥大および胆管の増生がみられた．小葉中心性の肝細胞肥大は被験物質による肝障害を反映した変化と考えられたが，類似の既存化学物質の3-ニトロベンゼナミンでも本試験と同様の変化が観察され3)，その類似物である1,3-ジニトロベンゼンには薬物代謝酵素誘導作用8)があることから，薬物代謝酵素の誘導との関連性も否定できなかった．また，胆管の増生は，本被験物質が胆管に障害を与えたことを示唆するが，壊死像がみられず血清中のアルカリフォスファターゼ活性にも変化がないことから障害は軽度なものと考えられた．また，300 mg/kg群の雌雄でクッパー細胞のヘモジデンリン沈着および髄外造血亢進がみられたが，これらは，脾臓同様，メトヘモグロビン血症に伴って貪食作用が亢進し，また，貧血に対して代償性に造血が亢進した結果と考えられた．
骨髄(大腿骨)では脾臓および肝臓と同様に，貧血に対する生体反応としての造血亢進が60 mg/kg以上の投与群の雌雄でみられた．
また，雌の投与群において甲状腺重量の増加がみられた．アニリン誘導体は，甲状腺ペルオキシターゼを阻害して抗甲状腺物質として作用する9)ことが知られている．また，本試験でその可能性が示唆された肝臓の薬物代謝酵素の誘導によりT3またはT4の代謝が亢進し，これに対するフィードバックとしてTSHの分泌が亢進，その結果，甲状腺が二次的に刺激されること10, 11)が知られている．しかし，本試験における各投与群の甲状腺重量は，背景データと比較して差がなく，組織学的検査においても変化がみられないことから生理的範囲内の変化と考えられた．なお，雄の300 mg/kg群において，肺の相対重量の増加がみられたが絶対重量には差がなく，組織学的検査においても変化がみられないことから偶発的な変化と考えられた．
なお，本被験物質の異性体である2,6-ジメチルアニリンは，ラットを用いた混餌投与によるがん原性試験において鼻腔粘膜に腫瘍を誘発することが報告されている が12)，本試験では鼻腔を検索対象としていないため，本被験物質の鼻腔粘膜に対する影響は不明であった． 休薬期間終了後において被験物質投与に関連すると考えられる変化は，300 mg/kg群では赤血球数の減少，平均赤血球容積ならびに平均赤血球血色素量の増加，尿沈渣中の小円形上皮細胞ならびに白血球の増加，摂水量ならびに尿量の増加および尿比重の減少，赤脾髄のヘモジデリン沈着，肝臓における胆管の増生，骨髄(大腿骨)における造血亢進，60 mg/kg群では尿量の増加および尿比重の減少，赤血球数の減少および赤脾髄のヘモジデリン沈着であったが，変化の度合は投与期間終了時に比べて軽減しており，いずれも本質的には可逆性の変化と考えられた．一方，腎臓では再生性の変化と考えられる尿細管の好塩基性変化が認められるものの，乳頭壊死，髄質内帯の鉱質沈着および皮質における間質の細胞浸潤については明確な回復が認められなかった．その他の変化についてはいずれも回復した．なお，休薬期間終了後血液学検査において300 mg/kg群で投与期間終了時とは逆にヘモグロビン量およびヘマトクリット値の増加がみられたが，貧血の回復期におけるリバウンド現象と考えられた．また，同用量群で直接ビリルビンの減少がみられたが，増加ではないので毒性学的意義はなく，副腎の絶対重量の減少がみられたが相対重量に差はなく毒性学的意義は乏しいと思われた．
以上の如く，2,3-ジメチルアニリンをラットに28日間反復投与した結果，主な変化が，300 mg/kg群の雌雄では赤血球，脾臓，肝臓および腎臓に，60 mg/kg群の雌雄では赤血球および脾臓に，さらに12 mg/kg群の雌では脾臓にみられ，本被験物質の標的臓器は赤血球，脾臓，肝臓および腎臓と考えられた．一方，12 mg/kg群の雄では変化は認められなかった．これらの結果から，本試験における2,3-ジメチルアニリンの無影響量は雄では12 mg/kg/day，雌では12 mg/kg/day を下回ると推定された．
| 1) | S. C. Gad, C. S. Weil, "Principles and Methods of Toxicology," 2, ed. by A, Wallace Hayes, Raven Press Ltd., New York, 1989, pp. 435-483. |
| 2) | 谷本義文，"血液学-ヒトと動物の接点-," 清至書院，1982, pp. 708-728. |
| 3) | 小野寺博志，化学物質毒性試験報告，1，147 (1994). |
| 4) | 古川文夫，化学物質毒性試験報告，1，227(1994). |
| 5) | 井上博之，化学物質毒性試験報告，3，143(1996). |
| 6) | 井上博之，化学物質毒性試験報告，3，195(1996). |
| 7) | 伊藤義彦，化学物質毒性試験報告，3，225(1996). |
| 8) | T. E. Cody, S. Witherup, L. Hastings, K. Stemmer, R. T. Christian, J. Toxicol. Environ. Health, 7, 829(1981). |
| 9) | C. C. Capen, R. A. Delellis, J. T. Yarrington, "Handbook of Toxicologic Pathology," eds. by W. M. Haschek, C. G. Rousseaux, Academic Press Inc., San Diego, 1991, pp. 771-735. |
| 10) | R. M. McClain, Toxicol. Pathol., 17, 294(1989). |
| 11) | R. H. Alison, C. C. Capen, D. E. Prentice, Toxicol. Pathol., 22, 179(1994). |
| 12) | U.S. Department of health and human services, Public health service, "National Toxicology Program Technical Report Series," No.278, National Institutes of Health, pp. 1-110. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 榎並倫宣 | ||
| 試験担当者： | 柳沢哲夫，畠山和久，田村一利， 沼田弘明，勝亦倶慶 | ||
| (株)ボゾリサーチセンター 御殿場研究所 | |||
| 〒412 静岡県御殿場市かまど1284 | |||
| Tel.0550-82-2000 | Fax.0550-82-2379 | ||
| Correspondence | ||||
| Authors: | Tomonori Enami(Study director) Tetsuo Yanagisawa， Kazuhisa Hatayama， Kazutoshi Tamura，Hiroaki Numata，Toyohisa Katsumata | |||
| Gotemba Laboratory，Bozo Research Center Inc. | ||||
| 1284, Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412, Japan | ||||
| Tel.+81-550-82-2000 | Fax.+81-550-82-2379 | |||