7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸
の細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 7-Amino-4-hydroxy-2-naphthalenesulfonic acid on Bacteria

要約

既存化学物質安全性点検作業の一環として，7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸の変異原性について遺伝子突然変異誘発性を検討するため，ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)TA100，TA98，TA1535およびTA1537株ならびに大腸菌(Escherichia coli) WP2 uvrA株を用いる復帰突然変異試験を行った．予備的な試験の結果を基に，試験用量を設定した．すなわち，直接法(-S9 mix)ならびに代謝活性化法(+S9 mix)の各菌株についてそれぞれ，156〜5000 μg/プレートの6用量を設定し試験した．その結果，代謝活性化法のネズミチフス菌4菌株で用量に依存した復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められ，再現性も確認された．特にTA98では溶媒対照に比較し90倍程度の増加を示した．直接法では，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．一方，各系での陽性対照物質は，それぞれの試験菌株に対し明確な突然変異誘発作用を示した．従って，本試験条件下において，7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸は微生物に対し遺伝子突然変異を誘起するものと判断した．

材料および方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰突然変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性の Salmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA15371)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和 58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所から分与を受けた．平成6年9月5日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO: MERCK社)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mlずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

日清製粉 (株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02%硫酸マグネシウム・7水塩，0.2%クエン酸・1水塩，1%リン酸二カリウム・無水塩，0.192%リン酸一アンモニウム，0.066%水酸化ナトリウム [いずれも最終濃度])に2%のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5%の寒天(OXOID社:No.1)を加え，30mlをシャーレに分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

Bacto-agar(DIFCO社)0.6%を含む0.5%塩化ナトリウム水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mM D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mM L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

内容量 200 mlの円筒容器(ストレージボトル：Corning Costar社)に2.5%ニュートリエントブロス(OXOID社)溶液を25 ml分注し，これに融解した菌懸濁液を50 ml接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37℃で8時間振盪(往復振盪:120回/分)培養し，試験に使用した．

4.　S9 mix

製造後 6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．

成　　分S9 mix 1ml中の量
S90.1 ml
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
リン酸緩衝Na-液(pH 7.4)100 μmol

5.　被験物質

被験物質の 7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸(ロット番号:0901，CAS No.:87-02-5)は分子式C10H9NO4S，分子量239.25，純度91.8%(不純物として硫酸ナトリウム分2.0 wt%および水分3.5 wt%を含む)の粉末で，水，アセトンにほとんど溶けない．本試験にはスガイ化学工業(株)から提供された被験物質を使用した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

なお，本被験物質の純度は 95％未満であるため秤量に際して換算した．

6.　被験物質溶液の調製

DMSOに被験物質を溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，直ちに処理を行った(用時調製)．

7.　試験用量の設定

8.00，40.0，200，1000および5000 μg/プレートの用量を用いて予備的な試験を実施した．その結果，直接法ならびに代謝活性化法のいずれの菌株においても試験菌株に対する生育阻害作用は観察されなかった．また，代謝活性化法の5000 μg/プレートにおいてすべての試験菌株で溶媒対照に比較し復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められた．

従って，本試験においては直接法ならびに代謝活性化法の各菌株について 5000 μg/プレートを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．

8.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は， DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20℃)した．
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン(ACR:ALDRICH社)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株))

9.　試験方法

Amesらの原法の改良法であるプレインキュベーション法1)に準じて，直接法および代謝活性化法それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質溶液あるいは陽性対照物質溶液を100 μl，次いで直接法の場合，0.1 Mナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μl，代謝活性化法の場合，S9 mixを500 μlおよび試験菌液100 μlを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，トップアガーを2 μl添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．独立して試験を2回実施した．

10.　結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ 2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

また陽性結果を示した菌株については，当該用量における誘発コロニー数 (当該用量のコロニー数−溶媒対照でのコロニー数)を試験用量(mg/プレート)で除すことにより比活性を算出した．

結果および考察

試験結果を Table 1〜4に示した．直接法(-S9 mix)ならびに代謝活性化法(+S9 mix)のいずれとも，7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸による生育阻害作用は観察されなかった．また，復帰突然変異コロニー数については，代謝活性化法のネズミチフス菌4菌株で用量反応相関性を伴った明確な増加傾向が観察された．特に，TA98で顕著な増加が認められ，変異原性の強さに関する相対的比較値である比変異活性は498を示した．さらに，大腸菌についても溶媒対照の2倍を超えることはなかったが，復帰突然変異コロニーの増加傾向が認められた．直接法については，いずれの菌株においても溶媒対照と同等の値であり，増加傾向は認められなかった．一方，陽性対照物質はそれぞれの菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，試験中析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．以上の試験結果から，本試験条件下において7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸の微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陽性と判定した．

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976)

連絡先
試験責任者：中嶋　圓
試験担当者：北沢倫世，菊池正憲，板倉真由実
（財）食品農医薬品安全性評価センター
〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence:
Authors:Madoka Nakajima(Study director)
Michiyo Kitazawa,
Masanori Kikuchi
Mayumi Itakura
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden Aza Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393