染色体異常試験に用いる濃度を決定するため,細胞増殖抑制試験を行ったところ,直接法48時間処理における約 50% の増殖抑制を示す濃度は 1.1 mg/ml であった.また,代謝活性化法の S9mix 存在下および非存在下における約 50% の増殖抑制を示す濃度は,それぞれ 1.6 mg/ml および 1.7 mg/ml であった.従って染色体異常試験において,直接法では 1.1 mg/ml,代謝活性化法では S9mix 存在下および非存在下ともに 1.7 mg/ml の処理濃度をそれぞれ高濃度とし,それぞれその 1/2 の濃度を中濃度,1/4 の濃度を低濃度として設定した.
直接法により,CHL 細胞を 24時間処理したすべての処理群において,染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった.また, 48時間処理した最高処理濃度(1.1 mg/ml)では,倍数性細胞の有意な増加が認められたが,その出現頻度は 2% 以下であり,判定は陰性であった.一方,代謝活性化法においては,S9mix 存在下および非存在下の最高処理濃度(1.7 mg/ml)で,観察した細胞のそれぞれ 9% および 7%(gapを含む)に染色体の構造異常が誘発され,判定は疑陽性であった.そこで再現性を確認するため,追加試験として代謝活性化法のS9mix 存在下および非存在下について, in vitro 小核試験を実施したところ, S9mix 存在下および非存在下の高濃度群(1.7 mg/ml)で小核の有意な増加が認められ,染色体異常誘発性に関して再現性が得られた.誘発された染色体異常の要因に関しては,被験物質を添加すると培養液が黄色化することからpHの低下による影響も示唆された.
以上の結果より1-ナフチル酢酸は,今回実施した試験条件下で,試験管内の CHL 細胞に染色体異常を誘発すると結論した.
直接法では,細胞播種3日目に被験物質を加え,24時間および48時間処理した.また,代謝活性化法では,細胞播種3日目にS9mixの存在下および非存在下で6時間処理し,処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した.
その結果,被験物質 の約 50% の増殖抑制を示す濃度を, 50%をはさむ 2濃度の値より算出したところ, 直接法では 1.1 mg/ml であった.また,代謝活性化法の S9mix 存在下および非存在下における約 50% の増殖抑制を示す濃度は,それぞれ 1.6 mg/ml および 1.7 mg/ml であった (Fig. 1).
代謝活性化法による染色体分析の結果を Table 2に示した.1-ナフチル酢酸を加えてS9mix 非存在下で6 時間処理した中濃度群(0.9 mg/ml)および高濃度群(1.7 mg/ml)で,倍数性細胞の有意な増加(それぞれ p=0.0110 および p=0.0000159)が認められた.また, S9mix 存在下の高濃度群(1.7 mg/ml)においても,倍数性細胞の有意な増加(p=0.00200)が認められた.しかしながら,その出現頻度はいずれも 5% 未満であり,石館らの判定基準では陰性であった.一方,S9mix 存在下および非存在下で 6時間処理した最高処理濃度群(1.7 mg/ml)では,観察した細胞のそれぞれ 9% および 7%(gap を含む)に染色体異常が認められ,疑陽性の結果が得られた.
そこで,代謝活性化法の S9mix 存在下および非存在下の条件について,再現性を確認するための追加試験として,染色体異常を精度よく反映することができるin vitro 小核試験を実施した(Table 3).その結果,S9mix 存在下および非存在下の高濃度群(1.7 mg/ml)において,小核の有意な増加か認められ,染色体異常の誘発性が確認された.
一方,本試験と並行して実施された 5種類の検定菌を用いる復帰突然変異試験では,直接法,代謝活性化法のいずれの試験においても変異原活性は認められなかった.
培地のpHが低下すると染色体異常が誘発されることが報告5)されている.細胞を用いる本実験では,1-ナフチル酢酸を培養液に加えると培養液の色が黄色に変化することから,代謝活性化法と同一条件における処理直後と処理終了時のpHを測定した.その結果,S9mix 非存在下における処理直後のpHは,5.92〜6.54であり,処理終了後では 5.13〜6.57であった.また,S9mix 存在下における処理直後のpHは,5.92〜6.65であり,処理終了後では 4.98〜6.52であった.従って,本実験で誘発された染色体異常に関しては,1-ナフチル酢酸添加による培地の酸性化による可能性と,1-ナフチル酢酸それ自身による DNA傷害作用に起因する可能性の 2通りが考えられる.
1) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編,“化学物質による染色体異常アトラス,”朝倉書店,1988. |
2) | 日本組織培養学会編,“細胞トキシコロジー試験法,”P.247-251,朝倉書店,1991. |
3) | 石館 基 監修,“〈改訂〉染色体異常試験データ集,”エル・アイ・シー社,1987. |
4) | Kastenbaum M. A.,Bowman K. O.,Mutat. Res.,9,527-549,1970. |
5) | Morita T., et al.,Mutat. Res., 240,195-206,1990. |
連絡先 | |||
試験責任者: | 田中憲穂 | ||
試験担当者: | 山影康次,佐々木澄志,若栗 忍,日下部博一,橋本恵子 | ||
(財)食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
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Authors: | Noriho Tanaka ( Study director ) Kohji Yamakage, Kiyoshi Sasaki, Shinobu Wakuri, Hirokazu Kusakabe, Keiko Hashimoto | ||
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