2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験
In Vitro Chromosomal Aberration Test of
Dimethyl 2,6-naphthalenedicarboxylate on Cultured Chinese Hamster Cells
要約
2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響について，チャイニーズ・ハムスター培養細胞(CHL/IU)を用いて染色体異常試験を実施した．
連続処理(24時間)，短時間処理(6時間)ともに 2.4 mg/ml(10 mM)の濃度においても 50% を明らかに越える増殖抑制は認められなかったことから，すべての試験において 2.4 mg/ml の濃度を最高処理濃度とし，連続処理(24時間および48時間)では公比2で4濃度群(0.30，0.60，1.2，2.4 mg/ml)，短時間処理では S9 mix 非存在下および S9 mix 存在下ともに公比2で3濃度群(0.60，1.2，2.4 mg/ml)設定した．すべての系列において，最高処理濃度で観察可能だったことから，染色体分析では，最高処理濃度(2.4 mg/ml)とその1/2および1/4の3処理濃度を観察対象とした．連続処理では，S9 mix 非存在下で24時間および48時間連続処理後，短時間処理では S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理(18時間の回復時間)後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．
CHL/IU 細胞を24時間および48時間連続処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常は認められなかった．一方，48時間連続処理した高濃度群(2.4 mg/ml)では，倍数性細胞が誘発されたが，誘発頻度は 1.25% であり，生物学的には陰性であると判断した．短時間処理では，S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．
以上の結果より，2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルは，上記の試験条件下で染色体異常を誘発しないと結論した．
方法
1．使用した細胞
リサーチ・リソースバンク(JCRB)から入手(1988年2月，入手時:継代4代，現在12代)したチャイニーズ・ハムスター由来の CHL/IU 細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．
2．培養液の調製
培養には，牛胎児血清(FCS:Cansera International)を 10% 添加したイーグル MEM(日水製薬 (株))培養液を用いた．
3．培養条件
2 × 10^4 個の CHL/IU 細胞を，培養液 5 ml を入れたディッシュ(径 6 cm，Corning)に播き，37℃の CO2 インキュベーター(5% CO2)内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目に S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．
4．被験物質
2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステル(略号:DMNDC，CAS No.:840-65-3，ロット番号:4O24，三菱ガス化学工業 (株))は，白色フレークで，水，DMSOおよびアセトンに対しては50 mg/ml でも溶解せず，不溶性の物質であるが，キシレンでは0.26 g/100 g(20℃)で溶解する．融点190.1℃，沸点370℃(推定)，蒸気圧 3.90 mmHg/200℃で，分子式 C14H12O4，分子量244.25，純度 99.9 wt%(不純物は不明)の物質である．
被験物質原体の安定性に関する情報は得られなかった．
5．被験物質の調製
被験物質の調製は，使用のつど行った．媒体は 0.5% CMC Na 水溶液(ナカライテスク(株))を用いた．原体を媒体に懸濁して原液を調製し，ついで原液を媒体で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 10%(v/v)になるように加えた．なお濃度の記載について，純度換算は行わなかった．
6．細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定
染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL/IU 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計(MonocellaterTM，オリンパス光学工業 (株))を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．
その結果，連続処理，短時間処理ともに，処理したすべての濃度範囲で 50% を明らかに越える増殖抑制作用は認められなかった(Fig．1)．
7．実験群の設定
細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理 ，短時間処理ともに 2.4 mg/ml(10 mM)とし，連続処理(24時間および48時間)では公比2で4濃度群(0.30，0.60，1.2，2.4 mg/ml)，短時間処理では S9 mix 非存在下および S9 mix 存在下ともに公比2で3濃度群(0.60，1.2，2.4 mg/ml)設定した．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC(MC，協和醗酵工業 (株))およびシクロホスファミド(CPA ，Sigma Chemical Co.)は，注射用水((株) 大塚製薬工場)に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．
染色体異常試験においては1濃度あたり4枚ディッシュを用い，そのうちの2枚は染色体標本を作製し，別の2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した．
8．染色体標本作製法
培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1μg/ml になるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を 3% ギムザ溶液で染色した．
9．染色体分析
細胞増殖率測定の結果と分裂指数により，20% 以上の相対増殖率で，かつ2ディッシュともに 0.5% 以上の分裂指数を示した最も高い濃度を観察対象の最高濃度群とし，観察対象の3濃度群を決定した．その結果(Table 1，2)，すべての系列において，最高処理濃度で観察可能だったことから，染色体分析では，最高処理濃度(2.4 mg/ml)とその1/2(1.2 mg/ml)および1/4(0.6 mg/ml)の3処理濃度を観察対象とした．
作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験(MMS)研究会1)による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞(polyploid)の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．
10．記録と判定
無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．
染色体異常を有する細胞の出現頻度について，溶媒の背景データと被験物質処理群間でフィッシャーの直接確率法2)(多重性を考慮して familywise の有意水準を 5% とした)により，有意差検定を実施した．また，フィッシャーの直接確率法で有意差が認められた場合には，用量依存性に関してコクラン・アーミテッジの傾向性検定3) (p<0.05)を行った．最終的な判定は，統計学的および生物学的な評価に基づいて行った．
結果および考察
連続処理による染色体分析の結果を Table 1 に示した．2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルを加えて24時間処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，48時間連続処理した高濃度群(2.4 mg/ml)において，観察した細胞の 1.25% に倍数性細胞の誘発が認められた．しかしながら，発生頻度が低いため，生物学的には陰性であると判断した．
短時間処理による染色体分析の結果を Table 2 に示した．2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルを加えて S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理したいずれの処理群においても，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．
従って，2,6-ナフタレンジカルボン酸ジメチルエステルは，上記の試験条件下で，試験管内の CHL/IU 細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．
文献
| 1) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編，"化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店，東京，1988． |
| 2) | 吉村 功編，"毒性・薬効データの統計解析，事例研究によるアプローチ," サイエンティスト社，東京，1987． |
| 3) | 吉村 功，大橋靖夫編，"毒性試験講座14，毒性試験データの統計解析," 地人書館，東京，1992，pp.218-223． |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 田中憲穂 |
| 試験担当者： | 山影康次，日下部博一，若栗 忍，
中川ゆづき，渡辺美香，
古畑紀久子，橋本恵子 |
| (財)食品薬品安全センター秦野研究所 |
| 〒257 神奈川県秦野市落合729-5 |
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | |
| Correspondence |
| Authors: | Noriho Tanaka(Study director)
Kohji Yamakage, Hirokazu Kusakabe,
Shinobu Wakuri, Yuzuki Nakagawa，
Mika Watanabe, Kikuko Furuhata,
Keiko Hashimoto |
| Hatano Research Institute，Food and Drug Safety Center |
| 729-5 Ochiai，Hadano，Kanagawa，257，Japan |
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | |