2-エチルアントラキノンの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 2-Ethylanthraquinone on Bacteria

要約

2-エチルアントラキノンについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．試験は2回繰り返して実施し，S9 mix無添加群の各試験菌株およびS9 mix添加群のTA1535，TA98ならびにTA1537でそれぞれ156〜5000 μg/plateの6用量，S9 mix添加群のTA100で2.44〜156 μg/plateの7用量，同群のWP2 uvrAで39.1〜5000 μg/plateの8用量で試験を実施した．

その結果，S9 mix添加群のTA100においてのみ僅かな復帰突然変異コロニー数の増加がみられたが，確認試験を2.44〜5000 μg/plateの12用量(1回目)ならびに156〜5000 μg/plateの6用量(2回目)で実施した結果，再現性のある陽性結果は得られなかった．

以上の結果より，本試験条件下では2-エチルアントラキノンは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．

方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成11年3月31日ならびに平成11年6月29日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80 ℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5 %の寒天(OXOID:No. 1)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5 %を含む0.6 % Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 %ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37 ℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4.　S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
成　　分S9 mix 1 mL中の量
S90.1 mL
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7. 4)100 μmol
精製水残　量

5.　被験物質

2-エチルアントラキノン(ロット番号:98-11056)は純度99.16 %(不純物としてアントラキノン0.01 %，硫黄分1.4 ppmおよび塩素分14.3 ppmを含む)の固体である．本剤は水にほとんど溶けず，DMSOおよびアセトンに可溶である．山本化成(株)(大阪)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質液の調製

試験の都度，モレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSO(MERCK KGaA)で被験物質を懸濁(5000 μg/plateのみ)あるいは溶解させ調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7.　試験用量の設定

19.5，78.1，313および1250 μg/plateの用量を用いて予備的な試験を実施した．S9 mix無添加群ならびに添加群のいずれの処理群においても試験菌株に対する生育阻害作用は観察されなかった．復帰突然変異コロニー数については，S9 mix添加群のTA100，WP2 uvrAならびにTA1537で僅かに増加する傾向がみられたため，これら3菌株を用いて追加試験(2.5〜160 μg/plate)を実施した．その結果，TA100においてのみ復帰突然変異コロニーに僅かな増加傾向が観察された．

従って，本試験においてはS9 mix無添加群の各試験菌株ならびにS9 mix添加群のTA100を除く試験菌株で5000 μg/plate，S9 mix添加群のTA100で156 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6〜8用量(公比2)を設定した．さらにS9 mix添加群のTA100における低用量域での陽性反応確認および高用量域での変異原性の有無を確認するため，確認試験1回目では2.44〜5000 μg/plateの計12用量(公比2)を，確認試験2回目では156〜5000 μg/plateの計6用量(公比2)を設定した．

8.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20 ℃)した．
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich社)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株))

9.　試験方法

Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/Lナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加した．さらに，試験菌液100 μLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37 ℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．なお，本試験1回目，同2回目，確認試験1回目および同2回目とも，156 μg/plate以上では被験物質の析出によりコロニーアナライザーの使用が不適当と判断したため，目視でコロニーを計数した．各濃度につき3枚のプレートを使用した．また，独立して試験を2回実施した．

10.　結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

1回目の試験結果をTable 1〜2に，2回目の試験結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群のいずれにおいても，2-エチルアントラキノン処理による生育阻害作用は観察されなかった．また，復帰突然変異コロニー数については，S9 mix添加群のTA100で僅かな増加傾向が認められた．従って，低用量域での復帰突然変異コロニーの増加傾向の再現性を確認するため，ならびに高用量域での変異原性の有無を調べるため，S9 mix添加群のTA100において確認試験を実施し，結果をTable 5〜6に示した．その結果，被験物質処理群のいずれの用量においても復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，コロニー計数時，S9 mix無添加群ならびに添加群とも156 μg/plate以上の用量で粉末状等の析出物が，5000 μg/plateでは懸濁液処理による残存物がプレート表面に観察された．以上の試験結果から，本試験条件下において，2-エチルアントラキノンの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．

なお，本被験物質の変異原性に関する報告はなかった．類縁体であるanthraquinoneについてはAmes試験で陽性3)，2-aminoanthraquinoneは染色体異常試験で陽性3)，1,4-diaminoanthraquinoneはAmes試験および染色体異常試験で陽性3)，1-aminoanthraquinoneはAmes試験で陽性4)，染色体異常試験で陰性4)との報告があった．

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976).
3)労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課監修，“労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，”日本化学物質安全・情報センター，東京，1996.
4)渋谷徹，化学物質毒性試験報告，3, 103-109(1996).

連絡先
試験責任者：中嶋　圓
試験担当者：植田ゆみ子，嶋田佐和子，北澤倫世
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Madoka Nakajima(Study Director) Yumiko Ueta, Sawako Shimada, Michiyo Kitazawa
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden , Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393