2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸の
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験
In Vitro Chromosomal Aberration Test of
2-Amino-1-naphthalenesulfonic acid on Cultured Chinese Hamster Cells
要約
OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸の培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響を評価するため，チャイニーズ・ハムスター培養細胞 (CHL/IU) を用いて試験管内染色体異常試験を実施した．
連続処理（24および48時間）においては，50%を明らかに越える増殖抑制濃度，すなわち1.6 mg/ml の濃度を最高処理濃度とした．一方，短時間処理（6時間）のS9 mix存在下および非存在下においては，2.2 mg/ml (10 mM) の濃度を最高処理濃度とした．最高処理濃度の1/2および1/4をそれぞれ中濃度，低濃度として設定した．連続処理として，S9 mix非存在下における24時間および48時間処理，短時間処理としてS9 mix存在下および非存在下で6時間処理（18時間の回復時間）後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．
CHL/IU細胞を24時間連続処理した高濃度群 (1.6 mg/ml) では，細胞毒性のため十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群においては，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．また，代謝活性化法では，S9 mix非存在下およびS9 mix存在下で6時間処理した高濃度群 (2.2 mg/ml) では，細胞毒性により十分な細胞数を分析できなかったが，S9 mix非存在下のその他の処理群では，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下の中濃度群 (1.1 mg/ml) では，観察した細胞の22.5%に染色体の構造異常が誘発され，陽性の結果が得られた．しかしながら，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸を培養液に添加すると培養液の色が黄色化することから，本実験で誘発された染色体異常に関しては，それ自身によるDNA傷害作用に起因する可能性に加えて，被験物質添加による培養液の酸性化による可能性も示唆された．
方法
1. 使用した細胞
リサーチ・リソースバンク (JCRB) から入手（1988年2月，入手時：継代 4代，現在12代）したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．
2. 培養液の調製
培養には，牛胎児血清（FCS：JRH BIOSCIENCES）を10%添加したイーグルMEM（日水製薬(株)）培養液を用いた．
3. 培養条件
2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mlを入れたディッシュ（径6 cm，Corning）に播き，37℃のCO2インキュベーター (5% CO2) 内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．
4. 被験物質
2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸（略号：ANS, CAS No.： 81-16-3，ロット番号：07021，スガイ化学工業(株)製造，(社) 日本化学工業協会提供）は，白色粉末で，水およびアセトンに不溶，ジメチルスルホキシド (DMSO) に可溶，分子式C10N9NO3S，分子量223.26，純度98.7%（不純物1.3%）の物質である．被験物質原体の安定性に関する情報は得られなかったが，水に安定であり，溶媒中 (DMSO) での安定性試験では，3.125〜220 mg/mlの濃度範囲で4時間は安定であった．
5. 被験物質の調製
被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒としてDMSO（Sigma Chemical Co.）を用いた．原体を溶媒に溶解して原液（増殖抑制試験 ，染色体異常試験ともに220 mg/ml）を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の1 % (v/v) になるように加えた．染色体異常試験に用いた被験物質調製液の濃度は，許容範囲内（溶媒中での平均含量が添加量の90.0〜110%）の値であった．なお，濃度の記載について，純度換算は行わなかった．
6. 細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定
染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計（MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株)）を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の陰性対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．
その結果，連続処理における50%の増殖抑制濃度を明らかに越える濃度（約60%の増殖抑制濃度）を，60%の増殖抑制濃度をはさむ2濃度の値より算出したところ，1.6 mg/mlであった．また，短時間処理のS9 mix非存在下では，2.0 mg/mlであった．一方，S9 mix存在下では，2.2 mg/ml (10 mM) の濃度を含み，処理したすべての濃度範囲で60%を越える増殖抑制は認められなかった (Fig. 1)．
7. 実験群の設定
細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理では1.6 mg/ml，短時間処理では2.2 mg/ml(10 mM) とし，それぞれ高濃度群の1/2の濃度を中濃度，1/4の濃度を低濃度とした．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC（MC，協和醗酵工業(株)）およびシクロホスファミド (CPA ，Sigma Chemical Co.) は，注射用水（(株)大塚製薬工場）に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．
8. 染色体標本作製法
培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mlになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各シャーレにつき6枚作製した．作製した標本を 3%ギムザ溶液で染色した．
9. 染色体分析
作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験 (MMS) 分科会1）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞 (polyploid) の有無について観察した．また構造異常については1群200個，倍数性細胞については1群800個の分裂中期細胞を分析した．
10. 記録と判定
無処理対照，陰性および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．染色体異常を有する細胞の出現頻度について，フィッシャーのexact probability test法により，陰性対照群と被験物質処理群間および陰性対照群と陽性対照群の有意差検定 (p＜0.05) を行った．被験物質の染色体異常誘発性についての判定は，石館ら2)の判定基準に従い，染色体異常を有する細胞の頻度が5%未満を陰性，5%以上10%未満を疑陽性，10%以上を陽性とした．
結果および考察
連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．
2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸を加えて24時間および48時間連続処理した高濃度群 (1.6 mg/ml) では，細胞毒性により十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発は認められなかった．
短時間処理による染色体分析の結果をTable 2に示した．
2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸を加えてS9 mix存在下および非存在化で6時間処理した高濃度群 (2.2 mg/ml) では，細胞毒性により十分な細胞数を分析できなかった．S9 mix非存在下のその他の処理群では染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下の中濃度群 (1.1 mg/ml) では，観察した細胞の22.5%に染色体の構造異常が誘発され，陽性の結果が得られた．
培養液がpH 6.3以下の酸性条件下では，染色体異常が誘発される場合があることが報告3）されている．2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸を培養液に添加すると培養液の色が黄色化することから，陽性の結果が得られたS9 mix存在下の中濃度群について，処理直後と処理終了後の培養液のpHを測定したところ，処理直後のpHは5.77で，処理終了後では6.01であった．従って，本実験で誘発された染色体異常に関しては，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸それ自身によるDNA傷害作用に起因する可能性に加えて，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸添加による培養液の酸性化による可能性が考えられる．これを明確にするには，さらに詳細な検討が必要であると思われる．
文献
| 1) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編," 化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店, 1988． |
| 2) | 石館 基 監修, "〈改訂〉染色体異常試験データ集," エル・アイ・シー社, 1987． |
| 3) | T. Morita, et al., Mutation Res., 268, 297-305, (1992). |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 田中憲穂 |
| 試験担当者： | 山影康次，若栗 忍，中川ゆづき，
日下部博一，橋本恵子 |
| （財）食品薬品安全センター秦野研究所 |
| 〒257 神奈川県秦野市落合 729-5 |
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | |
| Correspondence |
| Authors: | Noriho Tanaka ( Study director )
Kohji Yamakage, Shinobu Wakuri,
Yuzuki Nakagawa, Hirokazu Kusakabe,
Keiko Hashimoto |
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center |
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257, Japan |
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | |