2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸の細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2-Amino-1-naphthalenesulfonic acid on Bacteria

要約

　OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸について，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施した．

　検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537 1) およびEscherichia coli WP2 uvrA2) を用い，直接法および代謝活性化法のいずれも，用量設定試験は，50〜5000 μg/プレートの用量で，本試験は，312.5〜5000 μg/プレートの用量で試験を行った．

　その結果，2回の本試験とも，TA1535の代謝活性化法で2500 μg/プレート以上の用量で溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加が認められた．以上の結果から，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸は，用いた試験系において変異原性を有する（陽性）と判定された．

材料および試験方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

　S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆カリフォルニア大学のB.N. Ames 博士から分与を受けた．

　E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

　検定菌は，-80℃以下で凍結保存した．各検定菌は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異 (rfa) とアンピシリン耐性因子 (pKM101) の有無についての特性確認を行った．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2 (Oxoid) を入れたL字型試験管に種菌を接種し，37℃，10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

　2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 (CAS No. 81-16-3) は，白色粉末である．純度98.7%のもの（ロット番号：07021，不純物不明 (1.3%)，スガイ化学工業(株)製造）を(社)日本化学工業協会から供与された．被験物質は，使用時まで室温で遮光して保管した．

　2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸は，ジメチルスルホキシド（以下DMSOと略）に50 mg/mlになるように調製した後，同溶媒で更に公比2ないし約3で希釈したものを，速やかに試験に用いた．

　試験の開始に先立って，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸のDMSO溶液中での安定性試験を，本試験での低濃度 (3.125 mg/ml) および秦野研究所で実施される染色体異常試験 (H-93-243) の高濃度 (220 mg/ml) の2濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後4時間における各3サンプルの平均含量は，いずれも初期値（0時間）の平均に対して，101%であった．

　また，本試験Iに用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，3.125 mg/ml溶液の含量は既定濃度に対し，100〜102%，50 mg/ml溶液は，97.3〜97.8%であった．

　以上の結果から，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸はDMSO溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．

〔陽性対照物質〕

　用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF2 ： フリルフラマイド（上野製薬(株)）
SA ： アジ化ナトリウム（和光純薬工業(株)）
9AA ： 9-アミノアクリジン（Sigma Chem.Co.）
2AA ： 2-アミノアントラセン（和光純薬工業(株)）
　AF2, 2AAはDMSO（和光純薬工業(株)）に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSOに，SAは蒸留水に溶解して速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9混液の組成〕

1)　トップアガー（TA菌株用）

　下記の水溶液 (A) および (B) を容量比10:1の割合で混合した．

(A)バクトアガー (Difco)
塩化ナトリウム		0.6％
0.5％
(B) * L-ヒスチジン
ビオチン		0.5 mM
0.5 mM

* ： WP2 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地　

　培地は，日清製粉(株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1リットルあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・7水和物0.2g
クエン酸・1水和物2g
リン酸水素二カリウム10g
リン酸一アンモニウム1.92g
水酸化ナトリウム0.66g
グルコース20g
バクト・アガー (Difco)15g
　径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 混液（1 ml中下記の成分を含む）

S9 **0.1 ml
塩化マグネシウム8 mmol
塩化カリウム33 mmol
グルコース-6-リン酸5 mmol
NADH4 mmol
NADPH4 mmol
ナトリウム-リン酸緩衝液 (pH 7.4)100 mmol

**：7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製した S9 (キッコーマン(株)）を用いた．

〔試験方法〕

　プレート法を用いて，直接法および代謝活性化法によって試験を行った．

　小試験管中にトップアガー2 ml，被験物質調製液0.1 ml，リン酸緩衝液0.5 ml（代謝活性化試験においてはS9 混液0.5 ml），検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTable 1, 2に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

〔判定基準〕

　用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌の直接法あるいは代謝活性化法において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する（陽性）と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

　50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3とし，試験を実施したところ，すべての検定菌において直接法，代謝活性化法ともにいずれの用量においても抗菌性は認められなかったことから，本試験における最高用量を，すべての検定菌において，直接法，代謝活性化法ともに5000 μg/プレートとすることとした．

〔本試験〕

　結果をTable1, 2 に示した．2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸について，312.5〜5000 μg/プレートの範囲で，公比を2とし，試験を実施した．2回の試験において，TA1535の代謝活性化法の1250あるいは2500 μg/プレート以上の用量において溶媒対照の2倍以上となる変異コロニー数の増加が認められた．平均の比活性は5000 μg/プレートにおいて16.4であった．また，2回目の本試験においてのみ，TA1537の直接法および代謝活性化法とTA98の代謝活性化法において，変異コロニー数が陰性対照群の2倍以上となる群が散見された．

　以上の結果に基づき，2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸は，用いた試験系において変異原性を有するもの（陽性）と判定した．

文献

1)D.M. Maron, and B.N. Ames, Mutation Research., 113, 173, 1983.
2)M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures." B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols and C. Ramel eds., Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先
試験責任者：澁谷　徹
試験担当者：坂本京子，原　巧，堀谷尚古，
川上久美子，松本容彦，
飯田さやか，中込まどか
（財）食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya (Study Director)
Kyoko Sakamoto, Takumi Hara, Naoko
Horiya, Kumiko Kawakami,
Yasuhiko Matsuki,
Sayaka Iida and Madoka Nakagomi
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627