4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)の細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 4,4'-Oxybis(benzenesulfonylhydrazide) in Bacteria

要約

4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)について，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験菌株として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．用量設定試験においてはS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において2.29〜5000 μg/plateの8用量，本試験ではS9 mix無添加群および添加群のTA100で4.88〜156 μg/plateの6用量，WP2 uvrA で39.1〜1250 μg/plateの6用量，TA98およびTA1535で313〜5000 μg/plateの5用量，S9 mix無添加群のTA1535で2.44〜78.1 μg/plateの6用量，S9 mix添加群のTA1535で0.610〜19.5 μg/plateの6用量で試験を実施した．

その結果，S9 mix無添加群および添加群のTA100，TA1535およびWP2 uvrAにおいて，用量に依存した復帰突然変異コロニー数の増加が認められた．S9 mix無添加群のTA1537では，本試験において5000 μg/plateでのみ復帰突然変異コロニーの増加がみられ，陽性判定基準の2倍を僅かに超えたことから確認試験を実施した．確認試験においては復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は観察されず，再現性も認められないことから陰性反応と判断した．

以上の結果より，本試験条件下では4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)は，変異原性を有する(陽性)と結論した．

方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA15371)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA2)の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のAmes BN教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成13年10月2〜5日(TA100およびTA98)，平成13年10月19〜22日(TA1535およびWP2 uvrA)および平成14年5月23〜27日(TA1537)に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO: MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業)と1.5 %の寒天(伊那寒天BA-30 A)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5 w/v%を含む0.6 w/v% Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学)-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学)水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学)水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 w/v%ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No.2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック)を用い，37℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4.　S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
成分S9 mix 1 mL中の量
S90.1 mL
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
蒸留水残量

5.　被験物質

被験物質の4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)(ロット番号:403650)は純度99.3 %[不純物として4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホン酸)および4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルクロライド)を微量に含有する]の白色微粉末である．本剤は水に難溶，DMSOに易溶である．永和化成工業(京都)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質液の調製

試験の都度，被験物質をモレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSOを用いて溶解し，調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7.　試験用量の設定

2.29〜5000 μg/plateの8用量(公比3)を用いて用量設定試験を実施した．S9 mix無添加群および添加群のTA100，TA1535およびWP2 uvrAで用量に依存した復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められた．また，各試験菌株のいずれの処理群においても生育阻害作用は観察されなかった．被験物質処理時，S9 mix無添加群および添加群とも1667 μg/plate以上の用量で白色粉末状あるいは白色繊維状の析出物が認められた．コロニー計数時，両試験法の1667 μg/plate以上で白色粉末状の析出物が観察された．

従って，本試験においてTA100，TA1535およびWP2 uvrAでは，正確な用量反応曲線が求められるような用量，すなわち，S9 mix無添加群および添加群のTA100において156 μg/plateを，WP2 uvrAにおいて1250 μg/plateを，S9 mix無添加群のTA1535において78.1 μg/plateを，S9 mix添加群のTA1535において19.5 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．S9 mix無添加群および添加群のTA98ならびにTA1537においては，生育阻害作用が認められなかったことから5000 μg/plateを最高用量とし，それぞれ5用量(公比2)を設定した．

また，本試験のTA1537(S9 mix無添加群)において1用量のみ復帰突然変異コロニー数が溶媒対照の2倍を超えていたことから確認試験を実施し，5000 μg/plateを最高用量とした7用量(公比1.5)を設定した．

8.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20℃)した．
2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業)
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業)
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業)

9.　試験方法

Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/L ナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加し，さらに試験菌液100 μLを加え，37℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス)を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

10.　結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照の2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．なお，陽性と判定した菌株については，変異原性の強さの相対的比較値である比変異活性(比活性)を，当該濃度における誘発平均コロニー数(当該濃度での平均コロニー数−溶媒対照での平均コロニー数)を当該濃度値(mg)で除すことにより算出した．コロニー数の平均値は四捨五入する以前の値を用いた．

統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

用量設定試験の結果をTable 1〜2に，本試験の結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群ともTA100，TA1535およびWP2 uvrAにおいて，4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)処理による復帰突然変異コロニー数の増加傾向が認められた．さらに，S9 mix無添加群のTA1537において，5000 μg/plateで復帰突然変異コロニー数の僅かな増加が認められた．また，各試験菌株のいずれの処理群においても試験菌株に対する生育阻害作用は観察されなかった．変異原性の強さに関する相対的比較値である比活性の最高値は11475(S9 mix添加群，TA1535，4.88 μg/plate)と算出された．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，被験物質処理時，S9 mix無添加群で2500 μg/plate以上，S9 mix添加群では1250 μg/plate以上の用量で白色粉末状あるいは白色繊維状の析出物が認められた．コロニー計数時，両試験法の2500 μg/plate以上で白色粉末状の析出物が観察された．また，S9 mix無添加群のTA1537において，1用量のみ復帰突然変異コロニー数が溶媒対照の2倍を超えていたことから確認試験を実施し，結果をTable 5に示した．いずれの用量においても4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．一方，陽性対照物質はTA1537に対し，溶媒対照の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，被験物質処理時，1481 μg/plate以上の用量で，また，コロニー計数時，2222 μg/plate以上でそれぞれ白色粉末状の析出物が観察された．

以上の試験結果から，本試験条件下において，4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)の微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陽性と判定した．

なお，本被験物質[4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)]についてAmes試験で陽性との報告3)があった．また，類縁体であるβ-phenylethylhydrazine sulfateについてもAmes試験で陽性3)であった．さらに，本被験物質について，ラットおよびマウスを用いた UDS 試験についても陽性結果との報告4)があった．

文献

1)Maron DM, Ames BN: Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res, 113: 173-215(1983)．
2)Green MH, Muriel WJ: Mutagen testing using TRP+ reversion in Escherichia coli. Mutation Res, 38: 3-32(1978)．
3)清水英佑，林和夫，竹村望:ヒドラジン化合物の突然変異誘起性に関する研究，とくに発がん性との関係について．Nippon Eiseigaku Zasshi. Japanese Journal of Hygiene, 33: 474-485(1978)．
4)Mori H et al.: Genotoxicity of a Variety of Hydrazine Derivatives in the Hepatocyte Primary Culture/ DNA Repair Test Using Rat and Mouse Hepatocytes．Japanese Journal of Cancer Research，79: 204-211(1988)．

連絡先
試験責任者：中嶋　圓
試験担当者：仲村渠奈美子，田中仁，
春田由美江，永井美穂，
赤星まゆみ
（財）食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Madoka Nakajima(Study Director)
Namiko Nakandakari, Jin Tanaka,
Yumie Haruta, Miho Nagai,
Mayumi Akahoshi
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden , Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393