4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)のラットを用いる単回経口投与毒性試験

Single Dose Oral Toxicity Test of 4,4'-Oxybis(benzenesulfonylhydrazide) in Rats

要約

4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)の0，1000，1500および2000 mg/kgを1群につき雌雄各5匹のCrj:CD(SD)IGSラットに単回経口投与し，その毒性の概要を検討し，以下の成績を得た．

投与後2〜3日後に1000 mg/kgの雌，1500および2000 mg/kgの雌雄に爪先歩行，麻痺性歩行などの神経症状，さらに呼吸緩徐，眼・口・肛門周囲等の被毛汚れ，腹部の脱毛等がみられ，2000 mg/kgでは体重減少も認められた．1500 mg/kgの雄5例中1例および2000 mg/kgの雌雄各5例中2例が死亡し，剖検所見では死亡例に胸腺および脾臓の萎縮がみられ，生存例には脱毛が認められた．

以上のことから，本試験条件下におけるLD50値は雌雄とも2000 mg/kgを超える量と推定された．

方法

1.　被験物質および対照物質の調製

被験物質の4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)[ロット番号:403650，純度:99.3 wt%，提供者:永和化成工業(京都)]は，不純物として4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホン酸)および4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルクロライド)を微量に含有し，融点161.5℃，比重1.525，分解熱89.6 kcal/mol，燃焼熱1482 kcal/molの水に難溶(0.02 g/100 g，20℃)，DMSOに易溶，7 %塩酸に易溶(22.0 g/100 g，20℃)，アセトンに反応する(ケトン類とは反応して溶解する)等の性質を有する白色微粉末である．被験物質は常温では安定であるが，炎・火花・高温体と接触した場合，分解を起こして燃焼する(分解温度 164℃)ことから，直射日光を避け，風通しの良い冷暗所に保存した．試験期間中の被験物質の安定性を，残余被験物質を用いた純度の分析成績により確認した．

あらかじめ被験物質の調製液中での均一性および安定性の分析を行い，均一かつ室温保存13日間安定であることを確認した後，被験物質を乳鉢で細砕後，投与量ごとに精秤して対照物質(トウモロコシ油)に懸濁し，スターラーで分散させた．調製液は投与前日に1回調製し，調製後速やかに遮光気密容器に入れ室温で保存して投与に用いた．投与液の各濃度をHPLCで分析し，規定の範囲内にあることを確認した．

2.　試験動物および飼育条件

試験には，日本チャールス・リバー厚木飼育センター生産のSPF Crj:CD(SD)IGSラットを用いた．雌雄各24匹を4週齢で購入し，個々の動物について7日間馴化飼育後，雌雄各20匹を選抜して5週齢で試験に供した．投与前日の体重に基づいて層化無作為抽出法により群分けを行った．

動物は温度22〜24℃，湿度50〜65 %，換気回数10〜15回/時間，照明時間8時〜20時，ブラケット式金属製金網床ケージに，群分け前は3匹，群分け後は1匹収容した．飼料はγ線照射固型飼料CRF-1(オリエンタル酵母工業)を金属製給餌器により，飲料水は札幌市水道水を自動給水装置により，それぞれ自由摂取させた．

3.　投与量および投与方法

致死量の概要を検討するために，予備試験として1群につき雌雄各3匹のSD系ラット[Crj:CD(SD)IGS]にトウモロコシ油に懸濁した4,4'-オキシビス(ベンゼンスルホニルヒドラジド)の2000 mg/kgを，10 mL/kgの投与容量で単回経口投与した．その結果，投与後2日から雄2例と雌1例に麻痺性歩行，呼吸緩徐，血尿，投与後3日には体重減少および排糞量の減少が認められ，このうち雄1例は腹臥および体温低下を示した後に死亡した．残りの雌雄各1例は麻痺性歩行および排糞量の減少が投与後4あるいは5日までみられたが，いずれも投与後6日には回復した．剖検所見では，雄の死亡例1例および雌雄の生存例ともに異常は認められなかった．このことから，本試験では雌雄ともに最高用量に2000 mg/kg，以下1500および1000 mg/kgを設定し，これにトウモロコシ油を投与する対照群を加え雌雄各4群を設定した．

一晩(16〜17時間)の絶食後，9時〜10時の間に胃ゾンデを用いて強制的に胃内に10 mL/kgの投与容量で経口投与し，投与後約4時間を経過した時点で給餌を再開した．

4.　検査項目

1)　一般状態観察

全例について動物の生死，外観，行動等を，投与日(0日)の投与直後から投与後1時間までは連続して観察し，以降は投与後2，4および6時間に観察した．投与後1日から投与後14日の剖検日までは，1日1回以上観察した．異常が認められる場合は，その症状ならびに症状の発現および消失が観察された時刻を記録し，死亡動物は発見後速やかに剖検した．

2)　体重測定

全例について動物の体重を，0日(投与日の投与前)，投与後1，3，5，7，10および14日(剖検日)に，電子式上皿天秤を用いて測定した．0日から投与後14日までの体重増加量および体重増加率を算出した．

3)　剖検

全例について死亡例は発見後速やかに，生存例は投与後14日に体外表を観察後，エーテル麻酔下で腹部大動脈から放血して安楽死させ，いずれも全身の器官・組織を肉眼的に観察した．

5.　統計解析

体重，体重増加量および体重増加率について，Bartlettの検定法によって等分散性を解析し，等分散の場合は一元配置分散分析法，不等分散の場合はKruskal-Wallisの検定法で解析した．一元配置分散分析の結果，有意差がみられた場合は，Dunnettの検定法を用いて，Kruskal-Wallis法の解析の結果，有意差がみられた場合は，Mann-WhitneyのU-検定法を用いてそれぞれ対照群との比較を行った．対照群との比較検定については，危険率5 %未満を統計学的に有意とした．

結果

1.　死亡状況

1500 mg/kgの雄で投与後4日に5例中1例，2000 mg/kgの雄で投与後4および5日に各1例，雌では投与後3日に2例が死亡した．

2.　一般状態

1000 mg/kgでは，雌1例で投与後3日に爪先歩行と腹部の脱毛が認められた．

1500 mg/kgでは，雄2例で投与後3日に麻痺性歩行が認められ，1例では呼吸緩徐を伴い翌日死亡した．他の1例は呼吸緩徐や口周囲被毛の汚れも認められたが投与後8日には回復した．

2000 mg/kgでは，投与後2日に下痢および肛門周囲被毛の汚れが雄1例，爪先歩行が雌2例，投与後3日には爪先歩行や前肢の反転，麻痺性歩行，呼吸緩徐あるいは眼・口・肛門周囲等の被毛汚れや腹部の脱毛等が雌雄各4例にみられ，投与後5日までに雌雄各2例が死亡した．しかし，他は投与後8日までに腹部の脱毛を除き回復した．

3.　体重

各用量の雌雄で投与後1日に有意な低値が認められた．

1000および1500 mg/kgでは，雌雄ともに投与後3日以降に有意差はみられなかった．2000 mg/kgの雌雄では投与後3日にも体重減少がみられ，雄では投与後7日まで有意な低値が認められた．生存例の体重増加量および増加率には有意差は認められなかった．

4.　剖検

死亡例では，1500 mg/kgの雄1例，2000 mg/kgの雌雄各2例に胸腺および脾臓の萎縮が認められた．

生存例では，1000および2000 mg/kgの雌各1例に腹部皮膚に脱毛がみられた．

考察

一般状態では，投与後2〜3日経過後，雄で1500 mg/kg以上，雌で1000および2000 mg/kgに爪先歩行あるいは麻痺性歩行などの神経症状，さらに呼吸緩徐，眼・口・肛門周囲等の被毛汚れ，腹部の脱毛などの毒性徴候が発現し，雄で1500 mg/kg以上，雌で2000 mg/kgに死亡例も認められた．以上のように，最大耐量は雄で1000 mg/kg，雌で1500 mg/kgであるが，LD50値は雌雄ともに2000 mg/kgの投与で半数例以下の死亡率であることから，2000 mg/kgを超える量と推定された．

体重推移では，各用量の雌雄ともに投与後1日に有意な低値が認められた．2000 mg/kgでは投与後3日にも体重が減少し，雄では投与後7日まで低値がみられ，死亡例では投与時よりも低値であった．しかし，生存例では雌雄とも体重増加量や増加率に有意差は認められなかった．

剖検所見では，死亡例に胸腺および脾臓の萎縮がみられているが，この変化は死亡がやや遅延して発現することによる消耗性変化と推察された．なお，生存例の雌2例にみられた脱毛と被験物質投与との関連性については明らかでなかった．

以上のことから，被験物質投与により，眼・口・肛門周囲等の被毛汚れや体重減少を伴う爪先歩行，麻痺性歩行などの神経症状がやや遅延して発現し，消耗性の経過をたどって死亡するものと考えられ，本試験条件下におけるLD50値は雌雄とも2000 mg/kgを超える量と推定された．

連絡先
試験責任者：須永昌男
試験担当者：木口雅夫，咲間正志，笠原みゆき
平田真理子，古川正敏
（株）化合物安全性研究所
〒004-0839 札幌市清田区真栄363番24
Tel 011-885-5031Fax 011-885-5313

Correspondence
Authors:Masao Sunaga (Study director)
Masao Kiguchi，Masashi Sakuma，
Miyuki Kasahara，Mariko Hirata，
Masatoshi Furukawa
Safety Research Institute for Chemical Compounds Co., Ltd.
363-24 Shin-ei, Kiyota-ku, Sapporo, Hokkaido, 004-0839, Japan
Tel +81-11-885-5031Fax +81-11-885-5313