4,4'-スルホニルジフェノールのラットを用いる経口投与簡易生殖毒性試験

Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test of 4,4'-Sulfonyldiphenol
by Oral Administration in Rats

要約

4,4'-スルホニルジフェノールは耐熱性，耐光性改良のエポキシ樹脂およびポリカーボネート用，ポリスルホン，ポリエステル，フェノール樹脂等の原料コモノマー，合成タンニン，合繊フィックス剤，ポリマー架橋剤等の原料に使用されている1)．毒性情報としては，ラットの経口投与によるLD50値は4556 mg/kg 2)で，皮膚に刺激性を有し2)，ラットの28日間経口投与による無影響量は雌雄ともに40 mg/kgであるとの報告3)などがある．今回，4,4'-スルホニルジフェノールを10，60および300 mg/kgの用量でSD系ラット(1群雌雄各12匹)に交配前14日から交配を経て雄は計45日間，雌は妊娠，分娩を経て哺育3日まで経口投与し，反復投与毒性および生殖発生毒性について検討した．

1.　反復投与毒性

60および300 mg/kg群の雌雄に盲腸の膨満が認められ，病理組織学検査では，そのほとんどに粘膜上皮のび漫性増生が認められた．その他，300 mg/kg群では，雌雄とも投与開始後3日から剖検時まで体重増加の抑制および投与開始後3日に摂餌量の減少が認められた．また，雄では肝臓の相対重量の増加がみられ，病理組織学検査では，雌雄とも小葉中心性肝細胞肥大などが認められた．10 mg/kg群では，雌雄とも被験物質に起因する変化は認められなかった．

2.　生殖発生毒性

親動物では，300 mg/kg群において，交尾率，分娩率，出産率，黄体数，妊娠期間，分娩状態および哺育行動に被験物質に起因する変化は認められなかったが，性周期の延長，発情休止期の継続を示した動物の増加，着床数の低値傾向，着床率の減少および受胎率の減少傾向が認められた．児動物では，300 mg/kg群において，総出産児数，出産生児数および哺育4日の生児数に低値傾向が認められた．その他，300 mg/kg群では，出生率，性比，体重，新生児の4日の生存率，肛門・生殖結節間距離，一般状態，外表および剖検所見には，被験物質に起因する変化は認められなかった．10および60 mg/kg群では，親動物および児動物とも被験物質に起因する変化は認められなかった．

以上の結果から，4,4'-スルホニルジフェノールの反復経口投与による無影響量は雌雄とも10 mg/kg/dayと考えられた．生殖発生毒性に関する親動物および児動物の無影響量は60 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質

4,4'-スルホニルジフェノール[日華化学(株)(福井)，ロット番号UL6005，純度99.87 %]は，水に難溶でアセトンに113 g/100 g(25 ℃)，DMFに129 g/100 g(25 ℃)溶解する白色粉末である．被験物質は室温下で保管した．なお，被験物質は試験期間中安定であったことを確認した．被験物質は0.1 % Tween 80添加0.5 %カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液(CMC-Na:岩井化学薬品(株))に懸濁させ，投与に供するまで冷蔵・遮光保存し，調製後8日以内に使用した．なお，投与開始前に投与液中の被験物質の8日間の安定性および均一性を確認した．また，投与液の初回調製時に所定濃度であることを確認した．

2.　試験動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)から入手した雌雄のSD系ラット〔Crj:CD(SD)IGS〕を5日間検疫・馴化後，試験に供した．投与開始前日に体重別層化無作為抽出法により，1群につき雌雄各12匹を振り分けた．投与開始時の週齢は雌雄とも9週齢，体重範囲は雄が329〜374 g，雌が206〜251 gであった．検疫・馴化期間を含めた全飼育期間中，温度22 ± 2℃，相対湿度55 ± 15%，換気約12回/時，照明12時間/日(7:00〜19:00)に設定した飼育室を使用した．動物飼育には，妊娠・哺育期間を除く期間はステンレス製つり下げ式金網製ケージを，妊娠・哺育期間は実験動物用床敷(ベータチップ:日本チャールス・リバー(株))を敷いたポリカーボネート製ケージを使用した．交配期間は雌雄各1匹，哺育期間は1腹，その他の期間は1匹ずつ収容し，飼育した．動物には，オートクレーブ滅菌した実験動物用固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))および孔径5 μmのフィルター濾過後，紫外線照射した水道水をそれぞれ自由に摂取させた．

3.　投与量および投与方法

投与量設定試験として，SD系ラットの雌雄それぞれ各群3匹を用いて，4,4'-スルホニルジフェノールを100，300および1000 mg/kgの用量で14日間経口投与した．その結果，300および1000 mg/kg群の雌雄で体重の増加抑制あるいは減少，摂餌量の低値傾向あるいは低値，精のう重量の低値がみられ，300 mg/kg群の雄で盲腸の膨満が認められた．さらに，1000 mg/kg群では雌雄で盲腸の膨満，雄の胸腺，前立腺の低値などが認められた．以上の結果から，本試験では高用量を300 mg/kgとし，以下公比約5で中用量を60 mg/kg，低用量を10 mg/kgとした．また，媒体(0.1 % Tween 80添加0.5 % CMC-Na水溶液)のみを投与する対照群を設けた．投与期間は，雌雄とも交配前14日間，交配期間および雄は剖検前日までの計45日間，雌は交尾成立後，妊娠，分娩を経て哺育3日(交尾確認日を妊娠0日，分娩確認日を哺育0日とした)までの計40〜46日間とした．ただし，非分娩動物は交尾確認後25日まで投与した．投与の際はテフロン製胃ゾンデを用いて1日1回，午前中に強制経口投与した．投与液量は5 mL/kgとし，至近測定日の体重を基に算出した．

4.　反復投与毒性に関する観察・検査

1)　一般状態

全例について，生死，外観，行動等を投与前および投与後に毎日観察した．

2)　体重および摂餌量

体重は，雌雄とも投与開始日，投与開始後3，7，14日およびその後は週1回，交尾した雌は妊娠0，7，14，20日および哺育0，4日に測定した．また，雄では，投与開始日の体重を基準に，雌では，交配前期間，妊娠期間および哺育期間について，それぞれ投与開始日，妊娠0日および哺育0日の体重を基準に体重増加量を算出した．摂餌量は，交配期間を除き体重測定日に測定した．

3)　病理学検査

雌雄全例について，最終投与日の翌日にチオペンタールナトリウムの腹腔内投与による麻酔下で腹大動脈を切断・放血により安楽死させて剖検し，肝臓，胸腺，精巣，精巣上体，精のう，前立腺，子宮，卵巣および下垂体の重量を測定した．また，解剖日の体重を基に相対重量(対体重比)を算出した．さらに，これらの器官に加えて，膣および肉眼的異常部位の器官・組織を採取し，10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定して保存した．また，60および300 mg/kg群の盲腸で異常が認められたため，対照として対照群の雄全例と雌1例の盲腸も採取した．ただし，精巣および精巣上体はブアン液で固定した．病理組織学検査は，対照群と300 mg/kg群の雌雄全例について，上記の保存した器官・組織を常法に従ってヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製して鏡検した．その結果，雌雄の肝臓で被験物質に起因する変化が認められたため，10および60 mg/kg群の雌雄全例の肝臓についても検査した．

5.　生殖発生毒性に関する観察・検査

1)　生殖機能

投与開始日から交尾確認日まで雌の膣垢を毎日午前中に採取し，エオシン・チオニン染色して性周期を検査し，平均性周期日数を算出した．交配前の投与期間終了後，各群内で雄1雌1の交配対を設けて14日間を限度に昼夜同居させた．交尾確認は毎日午前中に行い，膣栓形成あるいは膣垢標本中に精子が認められた場合を交尾成立とし，その日を妊娠0日とした．交尾した対は雌雄を分離し，以後の検査に供した．これらの結果から，交尾所要日数(交配開始後，交尾成立までに要した日数)，交尾成立までに逸した発情期の回数，交尾率[(交尾動物数/同居動物数)×100]，受胎率[(受胎動物数/交尾動物数)×100]を算出した．

2)　分娩・哺育状態

交尾が確認された雌は全例を自然分娩させ，分娩状態を観察した．午前9時の時点で分娩が完了している動物を当該日分娩とし，その日を哺育0日とした．その後，新生児を生後4日(哺育4日)まで哺育させ，授乳，営巣，食殺の有無等の哺育状態を毎日観察した．母動物は剖検時に卵巣，子宮を摘出し，黄体数および着床数を検査した．なお，分娩しなかった動物は交尾確認後26日の剖検時に子宮を10 %硫化アンモニウム水溶液に浸漬して着床痕を染色し，着床の有無を確認した．これらの結果から，妊娠期間(妊娠0日から出産が確認された日までの日数)，出産率[(生児出産雌数/受胎雌数)×100]，着床率[(着床数/黄体数)×100]，分娩率[(総出産児数/着床数)×100]を算出した．

3)　新生児の観察・検査

(1)　新生児の観察

哺育0日に総出産児数(出産生児数，死産児数)，性別および外表異常の有無を検査した．その後，一般状態，死亡の有無等を哺育4日まで毎日観察した．哺育0および4日の生存児数から，出生率[(出産生児数/総出産児数)×100]，新生児の4日生存率[(哺育4日生児数/出産生児数)×100]を算出した．

(2)　体重

哺育0および4日に全生存児を個体ごとに測定した．また，哺育0日の体重を基準に体重増加量を算出した．

(3)　肛門・生殖結節間距離

哺育4日に全生存児の肛門・生殖結節間距離(AGD)をノギスを用いて測定した．また，個体間の体重差による測定値のバラツキを補正するため，哺育4日の体重の3乗根で除した相対距離(AGD/体重)を算出した．

(4)　剖検

哺育4日に全生存児の口腔を含む外表を検査した後，親動物と同様にして安楽死させ，剖検した．死亡動物は10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液に浸漬，固定した後，実体顕微鏡下で剖検した．

6.　統計解析

計量データについては，パラメトリックデータはBartlett法による等分散性の検定を行い，分散が等しい場合は一元配置分散分析を行った．分散が等しくない場合およびノンパラメトリックデータはKruskal-Wallisの検定を行った．群間に有意差が認められた場合はDunnett法またはDunnett型の多重比較を行った．計数データのうち，病理組織所見はa × bのx2検定を行い，有意差が認められた場合はArmitageのx2検定により対照群と各被験物質投与群間の比較を行った．その他の計数データは，Fisherの直接確率法により検定した．各検定の有意水準は5 %とし，新生児に関するデータは各母動物ごとに算出した平均値を標本単位とした．

結果

1.　反復投与毒性

1)　一般状態

300 mg/kg群の雄で投与開始後22日から投与終了日まで7例に，雌で投与開始後17日から妊娠15日まで1例に，投与直前あるいは直後に流涎が散見されたが，いずれも投与後約30分には回復した．10および60 mg/kg群の雌雄では異常は認められなかった．

2)　体重(Fig. 1, 2)

300 mg/kg群の雌雄で投与開始後3日から剖検時まで体重増加の抑制あるいは抑制傾向がみられ，体重および体重増加量に対照群との間に有意な差が散見された．その他，60 mg/kg群の雌で哺育4日の体重に対照群との間に有意な低値が認められた．

3)　摂餌量

300 mg/kg群の雌雄で投与開始後3日の摂餌量に対照群との間に有意な低値が認められた．また，10および60 mg/kg群において哺育4日の摂餌量に低値が認められた．

4)　器官重量(Table 1)

300 mg/kg群の雄で肝臓および下垂体の相対重量の増加，精のうの絶対重量の減少がみられ，それぞれ対照群との間に有意な差が認められた．10および60 mg/kg群の雌雄ではいずれの器官においても対照群との間に有意な差は認められなかった．

5)　剖検所見

60 mg/kg群の雌雄各1例および300 mg/kg群の雄全例および雌4例に盲腸の膨満が認められた．その他，対照群で腎盂拡張，精巣上体の結節，精のうの左右不対称，子宮内胎盤遺残が認められた．

6)　病理組織所見(Table 2)

被験物質に起因すると思われる変化が雌雄の盲腸と肝臓で認められた．盲腸では，粘膜上皮のび漫性増生が60 mg/kg群の雌1例，300 mg/kg群の雄11例および雌4例に認められ，吸収上皮の肥大と増生が顕著であった．このうち300 mg/kg群の雄5例および雌1例では吸収上皮のアポトーシス像と思われる単細胞壊死がしばしば認められた．なお，剖検時に盲腸の膨満がみられた60 mg/kg群の雄1例には明らかな変化は認められなかった．肝臓では，小葉中心性肝細胞肥大が300 mg/kg群の雄5例，雌で妊娠しなかった動物3例にみられ，髄外造血が対照群を含む各群の雌雄で認められた．その他，対照群を含む各群で肝臓における限局性炎症性細胞浸潤，小肉芽腫，巣状壊死および単細胞壊死，胸腺の萎縮，腎盂拡張，精巣上体の精子肉芽腫，前立腺のリンパ球浸潤が散発的にみられたが，300 mg/kg群で多発する傾向は認められなかったことから，被験物質投与との関連はないと判断した．なお，器官重量に高値がみられた雄の下垂体および低値のみられた精のうに異常は認められなかった．また，妊娠を成立させなかった雄および妊娠が成立しなかった雌の生殖器に異常は認められなかった．

2.　生殖発生毒性

1)　生殖機能(Table 3)

性周期検査では，300 mg/kg群で性周期の延長がみられ，6〜10日間の発情休止期の継続を示した動物が5例みられたが，交尾は全例で成立し，交尾率，交尾所要日数および交尾までに逸した発情期の回数とも対照群との間に有意な差は認められなかった．しかし，300 mg/kg群で発情休止期の継続を示した動物の内4例が受胎せず，受胎率の減少の傾向を示したが，対照群との間に有意な差は認められなかった．10および60 mg/kg群ではいずれの検査項目あるいは指標においても対照群との間に有意な差は認められなかった．

2)　分娩・哺育状態(Table 4)

300 mg/kg群の黄体数に変化はみられなかったが，着床数に減少傾向がみられ，着床率に対照群との間に有意な減少が認められた．また，300 mg/kg群の総出産児数には有意な差はみられなかったが，対照群と比較して低値であった．その他，対照群を含む各群とも出産率は100 %で，妊娠期間および分娩率に被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められなかった．また，対照群を含むいずれの母動物にも哺育行動に異常は認められなかった．

3)　新生児に及ぼす影響

(1)　新生児の観察(Table 4)

300 mg/kg群の総出産児数，出産生児数および哺育4日の生児数に減少傾向が認められた．その他，出生率および新生児の4日生存率に被験物質投与群と対照群との間に有意な差は認められず，対照群を含む各群の新生児に外表異常および一般状態に異常は認められなかった．なお，10 mg/kg群で雄の新生児数が多く，性比に有意な偏りがみられたが，60 mg/kg以上の投与群では認められないことから，被験物質投与との関連はない偶発的なものと考えられた．また，300 mg/kg群で総出産児数の雄に有意な低値がみられたが，同群内での性比は0.83であり，総出産児数の低値に伴うものであった．

(2)　体重(Table 4)

雌雄の体重および体重増加量とも対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．

(3)　肛門・生殖結節間距離(Table 4)

雌雄の肛門・生殖結節間距離および相対距離とも対照群と被験物質投与群との間に有意な差は認められなかった．

(4)　剖検

対照群を含む各群の哺育4日までの死亡児および哺育4日の生存児に異常は認められなかった．

考察

1.　反復投与毒性

被験物質の反復投与による一般毒性学的影響としては，300 mg/kg群の雌雄で投与開始後3日から剖検時まで体重増加の抑制および投与開始後3日に摂餌量の減少が認められた．剖検では，60および300 mg/kg群の雌雄で盲腸の膨満がみられ，組織学的にそのほとんどに粘膜上皮のび漫性増生が認められ，しばしば単細胞壊死を伴っていた．これら変化の主体は粘膜表層の吸収上皮であったことから，盲腸内容物の増加に伴う物理的刺激に対する反応と思われる．また，盲腸の膨満は同被験物質のラットを用いた28日間反復経口投与毒性試験3)においてもみられ，盲腸粘膜の過形成および粘膜上皮の単細胞壊死が認められていることから，被験物質による同質の変化と思われる．また，300 mg/kg群の雄で肝臓の相対重量の増加がみられ，組織学的に雌雄で小葉中心性肝細胞肥大が認められた．肝細胞肥大は一般に種々の化学物質の投与によってしばしば発現する変化であり，肝臓で薬物代謝酵素が誘導された場合に発現すると考えられていることから4)，被験物質による酵素誘導を示唆する変化かも知れない．また，同被験物質のラットを用いた28日間反復経口投与毒性試験3)においても肝臓重量の増加および小葉中心性肝細胞肥大および髄外造血が認められていることから，肝細胞肥大は被験物質による同質の変化と思われる．なお，本試験では，肝細胞肥大は雌では妊娠しなかった動物のみで認められており，分娩した動物では授乳の影響で肝細胞が生理的に肥大5)したため，被験物質による変化が隠蔽されたものと考えられる．また，同被験物質のラットを用いた28日間反復経口投与毒性試験3)において髄外造血が認められているが，本試験では発現数の増加が再現されなかったことについての原因は明らかではなく，動物の投与開始時の週齢および投与用量などの違いによるものかも知れない．その他，一般状態で流涎が300 mg/kg群の雌雄で数例に散見されたが，いずれも投与直前あるいは投与直後にみられ，投与後約30分には回復した．被験物質は刺激性を有するとの報告2)などから，流涎は被験物質の物理化学的な刺激などによって生じたものと思われ，反復投与による毒性を示唆する変化ではないと考えられる．また，哺育4日に10 mg/kg群の摂餌量および60 mg/kg群の体重，摂餌量に有意な低値がみられたが，他の期間に影響は認められず，300 mg/kg群の哺育4日に有意な差がみられなかったことから，被験物質とは関連のない偶発的なものと考えられる．

2.　生殖発生毒性

親動物の生殖機能としては，300 mg/kg群で性周期の延長がみられ，6〜10日間の発情休止期の継続を示した動物が5例認められた．また，用量設定試験でも300 mg/kg群で発情休止期の継続が3例中1例に認められていることから，被験物質による性周期への影響が疑われた．被験物質投与各群の交尾率は100 %で，交尾成立までに要した日数にも有意な差はみられず，交尾能に被験物質の影響は認められなかったが，300 mg/kg群で発情休止期の継続を示した動物の内4例が受胎せず，受胎率の減少傾向が認められた．また，300 mg/kg群で黄体数に変化はみられなかったが，着床数および総出産児数の減少傾向および着床率の減少が認められた．しかし，300 mg/kg群で分娩率および出生率に影響がみられなかったことから，受胎率および総出産児数の減少は着床前胚の損失の増加も一因と考えられる．なお，300 mg/kg群で器官重量に高値がみられた雄の下垂体および低値のみられた精のうの組織学的検査に異常はみられず，また，妊娠を成立させなかった雄および妊娠が成立しなかった雌の生殖器および下垂体の組織学的検査でも，不妊の原因と考えられる異常は認められなかったことから，雄親動物の受胎能の低下に対する原因は不明であった．その他，出生率，性比，体重，新生児の4日の生存率，肛門・生殖結節間距離，一般状態，外表および剖検所見などに異常は認められなかったことから，被験物質による出生後の新生児の成長には影響はないものと考えられる．

以上の結果から，4,4'-スルホニルジフェノールの反復経口投与による一般毒性学的影響として，60および300 mg/kg群の雌雄で盲腸の膨満と組織学的変化等が認められた．したがって本試験条件下における反復投与毒性に関する無影響量は雌雄とも10 mg/kg/dayと考えられる．また，生殖発生に及ぼす影響として，300 mg/kg群で性周期の延長，発情休止期の継続を示した動物の増加，受胎率，着床数，着床率および総出産児数の減少等が認められたことから，生殖発生毒性に関する親動物および児動物の無影響量は60 mg/kg/dayと考えられる．

文献

1)有機化合物辞典，講談社サイエンティフィク，東京，1985, pp.742.
2)Registry of Toxic Effects of Chemical Substances 1985-86 Edition.
3)榎並倫宣，高須正生，畠山和久，田村一利，津田敏治，勝亦倶慶，化学物質毒性試験報告，7, 75(1999).
4)J. A. Popp and R. C. Cattley, Hepatobiliary System, “Handbook of Toxicologic Pathology,” eds. by W. M. Haschek, C. G. Rousseaux, Academic Press, San Diego, 1991, pp.279-314.
5)A. Hollister, P. Okubara, J. G. Watson, S. Chaykin, Life. Sci., 5, 40(1987).

連絡先
試験責任者：東川国男
試験担当者：勝田　修，竹田みどり，鈴木美江
(株)三菱化学安全科学研究所　鹿島研究所
〒314-0255　茨城県鹿島郡波崎町砂山14
Tel 0479-46-2871Fax 0479-46-2874

Correspondence
Authors:Kunio Higashikawa(Study director)
Osamu Katsuta, Midori Takeda, Yoshie Suzuki
Mitsubishi Chemical Safety Institute Ltd., Kashima Laboratory
14 Sunayama, Hasaki-machi, Kashima-gun, Ibaraki, 314-0255, Japan.
Tel +81-0479-46-2871Fax +81-0479-46-2874