検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537 1)およびEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用い，S9 mix無添加および添加試験のいずれも，Salmonellaの4菌株において用量設定試験で抗菌性が認められたことから，本試験はS9 mix無添加試験ではWP2 uvrAは313〜5000 μg/plate，TA100と TA98では2.44〜78.1 μg/plate，TA1535とTA1537では 0.61〜19.5 μg/plateの範囲で，S9 mix添加試験では WP2 uvrAは313〜5000 μg/plate，TA98では19.5〜 625 μg/plate，その他の検定菌では4.88〜156 μg/plate の範囲で実施した．
その結果，2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．
以上の結果から，N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与された．
E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与された．
検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)およびアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．
N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは，ジメチルスルホキシド(DMSO，和光純薬工業(株)，ロット番号:TPJ5678)に溶解して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．
| AF2 | : | 2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル) アクリルアミド(和光純薬工業(株)) |
| SA | : | アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株)) |
| 9AA | : | 9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.) |
| 2AA | : | 2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株)) |
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．
| (A) | バクトアガー(Difco Lab.) | 0.6 w/v% |
| 塩化ナトリウム | 0.5 w/v% | |
| (B)* | L-ヒスチジン | 0.5 mM |
| D-ビオチン | 0.5 mM |
| * | : | WP2 uvrA用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた． |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2 g |
| クエン酸・1水和物 | 2 g |
| リン酸水素二カリウム | 10 g |
| リン酸一アンモニウム | 1.92 g |
| 水酸化ナトリウム | 0.66 g |
| グルコース | 20 g |
| 大洋寒天(清水食品) | 15 g |
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．
| S9** | 0.1 mL |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース-6-リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4) | 100 μmol |
| ** | : | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製されたS9(キッコーマン(株))を用いた． |
小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37℃で20分間プレインキュベーションしたのち，約45℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．同時に実施した試験については，溶媒および陽性対照群を共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた復帰変異コロニー数を目視またはコロニーアナライザーを用いて算定した．抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性を確認した．
S9 mix無添加試験のSalmonellaの4菌株においては，すべての用量で抗菌性が認められたため，0.500〜50.0 μg/plateの用量で再度用量設定試験を実施した．その 結果，TA1535とTA1537では15.0 μg/plate以上で，TA100とTA98では50.0 μg/plateで抗菌性が認められた．
したがって，本試験における最高用量は，S9 mix無添加試験については，WP2 uvrAでは5000 μg/plate，TA100とTA98では78.1 μg/plate，TA1535とTA1537では19.5 μg/plateとした．また，S9 mix添加試験では，WP2 uvrAでは5000 μg/plate，TA98では625 μg/plate，TA100，TA1535およびTA1537では156 μg/plateとした．
上記の最高用量に基づいて，公比2で5〜6用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1, 2)．その結果，すべての検定菌において，2回の試験とも溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められず，陰性であった．
以上の結果に基づき，N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．
なお，本被験物質はチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験では，S9 mix 非存在下において染色体の構造異常が誘発され，陽性であった4)．本被験物質の類縁化合物については，簡単な情報検索を行ったが，変異原性に関する情報は得られなかった．
| 1) | D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F. J. de Serres, J. Ashby, Elsevier, North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360. |
| 3) | T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285. |
| 4) | 厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修，"化学物質毒性試験報告，"Vol. 7，化学物質点検推進連絡協議会，東京，1999, p. 537. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 原 巧，川上久美子 | ||
| (財)食品薬品安全センター 秦野研究所 | |||
| 〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
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| Authors: | Tohru Shibuya(Study Director) Takumi Hara, Kumiko Kawakami | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | ||||
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