N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの
細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of N-(1,3-Dimethylbutyl)-N'-phenyl-p-phenylenediamine
on Bacteria

要約

N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンについて,細菌を用いる復帰変異試験を実施した.

検定菌として,Salmonella typhimurium TA100,TA1535,TA98,TA1537 1)およびEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用い,S9 mix無添加および添加試験のいずれも,Salmonellaの4菌株において用量設定試験で抗菌性が認められたことから,本試験はS9 mix無添加試験ではWP2 uvrAは313〜5000 μg/plate,TA100と TA98では2.44〜78.1 μg/plate,TA1535とTA1537では 0.61〜19.5 μg/plateの範囲で,S9 mix添加試験では WP2 uvrAは313〜5000 μg/plate,TA98では19.5〜 625 μg/plate,その他の検定菌では4.88〜156 μg/plate の範囲で実施した.

その結果,2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても,溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった.

以上の結果から,N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

方法

1. 検定菌

Salmonella typhimurium TA100,TA1535,TA98,TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いた.

S. typhimuriumの4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国,カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与された.

E. coli WP2 uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与された.

検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い,各菌株の特性確認は,凍結保存菌の調製時に,アミノ酸要求性,UV感受性,膜変異(rfa)およびアンピシリン耐性因子pKM 101(プラスミド)の有無について調べ,特性が維持されていることを確認した.

試験に際して,ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し,37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした.

分光光度計により660 nmの吸光度を測定し,検定菌液の増殖を確認した.

2. 被験物質

N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは,暗紫褐色粒状固体である.用いた被験物質は,ロット番号70911,純度99 %(不純物:N-フェニル-1,4-ベンゼンジアミン)であり,精工化学(株)(東京)から供与された.被験物質は,使用時まで密封して冷蔵,遮光して保管した.本被験物質は試験期間中安定であったことが確認された.

N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは,ジメチルスルホキシド(DMSO,和光純薬工業(株),ロット番号:TPJ5678)に溶解して最高用量の調製液を調製した後,同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた.

3. 陽性対照物質

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである.
AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル) アクリルアミド(和光純薬工業(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))

AF2,9AAおよび2AAはDMSOに,SAは超純水に溶解したものを-20℃で凍結保存し,解凍後,速やかに試験に用いた.

4. 培地および S9 mix の組成

1) トップアガー(TA菌株用)

下記の水溶液(A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した.
(A)バクトアガー(Difco Lab.)0.6 w/v%
塩化ナトリウム0.5 w/v%
(B)*L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5 mM
*:WP2 uvrA用には,0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた.

2) 合成培地

培地は,極東製薬工業(株)製の最少グルコース寒天培地を用いた.なお,培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである.
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
大洋寒天(清水食品)15 g

径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである.

3) S9 mix

1 mL中下記の成分を含む.
S9**0.1 mL
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコース-6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
**:7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製されたS9(キッコーマン(株))を用いた.

5. 試験方法

プレインキュベーション法3)により,S9 mix無添加試験およびS9 mix添加試験を行った.

小試験管中に,被験物質調製液0.1 mL,リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL),検定菌液0.1 mLを混合し,37℃で20分間プレインキュベーションしたのち,約45℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し,合成培地平板上に流して固めた.また,対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒,または数種の陽性対照物質溶液を用いた.各検定菌ごとに用いた陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した.同時に実施した試験については,溶媒および陽性対照群を共通とした.培養は37℃で48時間行い,生じた復帰変異コロニー数を目視またはコロニーアナライザーを用いて算定した.抗菌性の有無については,肉眼あるいは実体顕微鏡下で,寒天表面の菌叢の状態から判断した.用いた平板は用量設定試験においては,溶媒および陽性対照群では3枚ずつ,各用量については1枚ずつとした.また,本試験においては,両対照群および各用量につき,3枚ずつを用い,それぞれの平均値と標準偏差を求めた.用量設定試験は1回,本試験は2回実施し,結果の再現性を確認した.

6. 判定基準

用いた5種の検定菌のうち,1種以上の検定菌のS9 mix無添加試験あるいはS9 mix添加試験において,被験物質を含有する平板上における復帰変異コロニー数の平均値が,溶媒対照値の2倍以上に増加し,その増加に再現性および用量依存性が認められた場合に,当該被験物質は本試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定することとした.

結果および考察

50.0〜5000 μg/plateの範囲で公比を約3として,用量設定試験を実施した.その結果,S9 mix無添加試験においては,TA100,TA1535,TA98およびTA1537ではすべての用量で抗菌性が認められたが,WP2 uvrAでは抗菌性は認められなかった.また,S9 mix添加試験においては,TA100,TA1535およびTA1537では150 μg/plate以上で,TA98では500 μg/plate以上で抗菌性が認められたが,WP2 uvrAでは抗菌性は認められなかった.

S9 mix無添加試験のSalmonellaの4菌株においては,すべての用量で抗菌性が認められたため,0.500〜50.0 μg/plateの用量で再度用量設定試験を実施した.その 結果,TA1535とTA1537では15.0 μg/plate以上で,TA100とTA98では50.0 μg/plateで抗菌性が認められた.

したがって,本試験における最高用量は,S9 mix無添加試験については,WP2 uvrAでは5000 μg/plate,TA100とTA98では78.1 μg/plate,TA1535とTA1537では19.5 μg/plateとした.また,S9 mix添加試験では,WP2 uvrAでは5000 μg/plate,TA98では625 μg/plate,TA100,TA1535およびTA1537では156 μg/plateとした.

上記の最高用量に基づいて,公比2で5〜6用量を設定して2回の本試験を実施した(Table 1, 2).その結果,すべての検定菌において,2回の試験とも溶媒対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められず,陰性であった.

以上の結果に基づき,N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは,用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した.

なお,本被験物質はチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験では,S9 mix 非存在下において染色体の構造異常が誘発され,陽性であった4).本被験物質の類縁化合物については,簡単な情報検索を行ったが,変異原性に関する情報は得られなかった.

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F. J. de Serres, J. Ashby, Elsevier, North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360.
3)T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285.
4)厚生省生活衛生局企画課生活化学安全対策室監修,"化学物質毒性試験報告,"Vol. 7,化学物質点検推進連絡協議会,東京,1999, p. 537.

連絡先
試験責任者:澁谷 徹
試験担当者:原  巧,川上久美子
(財)食品薬品安全センター 秦野研究所
〒257-8523 神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kumiko Kawakami
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627