N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの
ラットを用いる単回経口投与毒性試験

Single Dose Oral Toxicity Test of
N-(1,3-Dimethylbutyl)-N'-phenyl-p-phenylenediamine in Rats

要約

N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの単回経口投与毒性試験を，1群5匹からなる5週齢の雌雄のSprague-Dawley系(Crj:CD)ラットを用いて実施した．投与量は雌雄とも0(コーンオイル)，250，500，1000および2000 mg/kgとし，観察は投与日を観察第1日として投与後14日間行った. 死亡例については発見後速やかに，生存例については観察第15日に屠殺，剖検し以下の成績を得た．

雄では1000 mg/kg投与群で2例，2000 mg/kg投与群では全例が，雌では1000 mg/kg投与群で3例，2000 mg/kg投与群では全例がそれぞれ死亡した．死亡はいずれも観察第2日以降，第4日までに認められた．投与当日には腹臥位姿勢，自発運動の低下，後肢の脱力, 歩行異常ならびに流涙が散見され，観察第2日には，排便量の減少，自発運動の低下，下痢便，呼吸数の減少，体温の低下ならびに腹臥位姿勢が認められたが，このうち呼吸数の減少および体温の低下は死亡例において観察された．症状は観察第3日以降回復傾向を示し，観察第4日以降には一般状態の異常は認められなかった．雌雄の1000 mg/kg以上の投与群において，観察第2日に体重増加の抑制が認められたが，生存例では早期に回復傾向を示した．病理学検査の結果，被験物質投与による消化管および呼吸器系に対する影響が示唆された．

これらのことより，本試験条件下ではN-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの雌雄ラットにおけるLD50値は500〜2000 mg/kgの間にあると推定され，経口投与時の標的器官は主に消化管および呼吸器であることが推測された．

方法

1.　被験物質および投与検体の調製法

被験物質は，精工化学(株)(東京)より提供されたN-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン(ロット番号:70911，純度:99 %，融点:49℃，沸点:380℃，暗紫褐色粒状固体)を使用し，入手後，使用時まで密封して冷蔵，遮光保管した．試験に使用した被験物質の残余は試験終了後，提供者により純度を測定し，試験期間中の経時変化がなかったことを確認した．投与に使用する検体の調製においては，必要量の被験物質を秤量し，コーンオイル(ロット番号:V7R2020，ナカライテスク(株))を加えて溶解させ，投与時まで冷蔵で遮光保管した．なお，被験物質は0.800および200 mg/mLの濃度になるようにコーンオイルで溶解した状態で，調製後8日間は安定であり，また，各投与検体中の平均含量は所定濃度の規定範囲内にあることが確認された．

2.　投与量の設定および投与方法

本試験における投与量は，反復投与毒性試験のための予備試験の結果を基に決定した．すなわち文献検討の結果，ラット単回経口投与時のLD50値が，2500〜3340 mg/kgの範囲にあったことから1)，ラットにおける経口投与時の毒性は弱いと推定し，反復投与毒性試験の予備試験として1群5匹からなる雌雄ラットに100，300および1000 mg/kgを7日間反復投与した．その結果，初回投与後にはいずれの群にも症状は観察されなかったものの，反復投与の結果1000 mg/kg投与群では腹臥位姿勢，歩行異常，散瞳等の症状がみられ4例が死亡した．300 mg/kg以下の投与群では一過性の流涎以外，異常な症状ならびに死亡は認められなかった．以上の予備試験の結果，N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの単回投与時の最小致死量は300 mg/kgから2000 mg/kgの間にあると推定し，2000 mg/kgを最高用量に設定した．高用量以下は公比2で除し，1000，500および250 mg/kgの投与群を設け，また，媒体がコーンオイルであることからN-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン投与群と同容量のコーンオイルを投与する対照群を設定した．

投与容量は，体重1 kg当たり10 mLとし，動物をあらかじめ約19時間絶食させた後，投与直前に測定した体重を基に投与液量を計算し，ラット用胃管を用いて強制的に単回経口投与した．投与は午前11時〜12時の間に行い，給餌は投与後約4 時間に再開した．

3.　使用動物および飼育方法

4週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD, SPF)雌雄ラットを，日本チャールス・リバー(株)厚木飼育センターから購入し，飼育環境への馴化と検疫を兼ねて7日間飼育した．

全飼育期間を通じ，動物を金属製金網床ケージに1匹ずつ収容し，温度23.5〜25.0℃，湿度54〜66 %，換気回数約15回/時，照明12時間(7時〜19時点灯)に制御された飼育室で，固型飼料(CE-2，日本クレア(株))および水道水(秦野市水道局給水)を自由に摂取させて飼育した．

4.　群構成

試験には予備飼育中の一般状態に異常が認められなかった雌雄各25匹を用い，投与前日の測定体重を基に体重別層化無作為抽出法により1群5匹からなる5群に分け，5週齢で使用した．

5.　観察および検査

投与日を観察第1日とし，投与後14日間にわたって死亡の有無を確認し，各動物の一般状態を観察した．観察は投与日においては投与直後から1時間まで連続して行った．以降は投与後6時間まで約1 時間間隔で実施した．観察第2日から15日までは毎日1回行った．体重は全例について，投与直前，観察第2，4，8，11および15日に測定した．投与後の死亡例については，発見次第体重を測定した後，速やかに剖検した．また，観察第15日に生存例全例をペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血屠殺して剖検した．

結果

1.　死亡動物(Table 1)

雄では1000 mg/kg投与群で2例，2000 mg/kg投与群で5例全例が，雌では1000 mg/kg投与群で3例，2000 mg/kg投与群で5例全例が死亡した．死亡はいずれも観察第2日以降，第4日までに認められた．

2.　一般状態

投与当日には腹臥位姿勢が雄の1000 mg/kg以上の投与群，雌の2000 mg/kg投与群でそれぞれ6例および1例に，自発運動の低下が雌雄の2000 mg/kg投与群でそれぞれ3例および1例に，後肢の脱力が雄の1000 mg/kg以上，雌の2000 mg/kg投与群でそれぞれ4例および1例に，歩行異常(よろめき歩行)が雄の2000 mg/kg投与群で1例に，流涙が雌の2000 mg/kg投与群で1例にそれぞれ認められた．観察第2日には，排便量の減少が500 mg/kg以上の投与群の生存例の雌雄全例で認められ，一部の動物では観察第3日まで継続して観察された．1000 mg/kg以上の投与群ではさらに観察第2日に腹臥位姿勢，自発運動の低下および下痢便が散見された．死亡例には呼吸数の減少および体温の低下が観察された動物もあった．これらの症状は観察第3日以降は回復の傾向を示し，観察第4日以降は認められなかった．

3.　体重測定

雌雄の1000 mg/kg以上の投与群においては，観察第2日に体重増加の抑制が認められたが，雄では観察第8日以降，雌では観察第4日以降は回復傾向を示した．

4.　病理学検査

死亡例では，前胃の穿孔が1000 mg/kg投与群の雌1 例に観察され，肝臓表面に食物残渣も認められた．さらに，前胃粘膜の白濁が2000 mg/kg投与群の雌1例に，前胃粘膜の肥厚が1000 mg/kg投与群の雌1例に，腺胃粘膜の白濁が2000 mg/kg投与群の雌雄全例，1000 mg/kg投与群の雄1例に観察され，このうち，2000 mg/kg投与群の雌雄各1例では，粘膜の剥離も認められた．また，胃の拡張が2000 mg/kg投与群の雌雄全例，1000 mg/kg投与群の雄2 例，雌3 例に，腺胃の黒色斑が1000 mg/kg投与群の雄1例に認められた．また，小腸内腔の白色あるいは黄色流動物が2000 mg/kg投与群の雄全例，雌4例，1000 mg/kg投与群の雌雄各1例に，大腸内の黄色流動物が2000 mg/kg投与群の雌雄各1例にみられた．一方，肺の暗色部あるいは暗赤色化が，2000 mg/kg投与群の雄3例，1000 mg/kg投与群の雌雄各1例に，肺の気腫様変化(退縮不全)が1000 mg/kg投与群の雌雄各1例に，胸水の貯留および胸腺の白濁が，1000 mg/kg投与群の雄1例に観察された．また，肝臓の腫脹が1000 mg/kg投与群の雄1例，雌2例に，肝臓の淡色化が1000 mg/kg投与群の雌1例に，腎臓の淡色化および腹腔内の血液貯留が 1000 mg/kg投与群の雌1例に，被毛の汚れが2000 mg/kg投与群の雌雄各3例，1000 mg/kg投与群の雄1例，雌2例にみられた．

観察期間終了時剖検例では，前胃粘膜の白色あるいは白濁肥厚部が1000 mg/kg投与群の雄2例および500 mg/kg投与群の雌2例に観察されたほか，脾臓の濾胞の明瞭化が1000 mg/kg投与群の雌1例に，腎盂の拡張が250 mg/kg投与群の雄1例に観察された．

考察

N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンは，酸化防止剤やゴムの老化防止剤として使用される化学物質であり，ラット単回経口投与時のLD50値は，2500〜3340 mg/kgであるとされているが1)，死亡状況ならびに発現した症状や認められた所見等は明らかになっていない．今回，N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミンの250，500，1000および2000 mg/kgを雌雄それぞれ1群5匹からなる5週齢のSprague-Dawley系(Crj:CD)雌雄ラットに単回強制経口投与したところ，雄では1000 mg/kg投与群で2例，2000 mg/kg投与群で全例が，雌では1000 mg/kg投与群で3例，2000 mg/kg投与群で全例がそれぞれ死亡したことから，本試験条件下では被験物質の雌雄ラットにおけるLD50値は，500〜2000 mg/kgの間にあると推定された．

死亡例では，前胃の穿孔，胃粘膜の肥厚および白濁，粘膜の剥離，胃の拡張および黒色斑等の所見がみられ，観察期間終了時剖検例においても，前胃粘膜の白色あるいは白濁肥厚部が認められることから，被験物質による消化管に対する影響が疑われた．一方，死亡例においては，肺の暗色部あるいは暗赤色化，気腫様変化ならびに胸水の貯留が観察されることから，被験物質の投与による呼吸器系に対する影響も考えられた．

文献

1)Data and Handling Precautions, Safety International Working Group on the Toxicology of Rubber Additives (1984).

連絡先
試験責任者：大原直樹
試験担当者：高島宏昌，松本浩孝，一原佐知子，稲田浩子，永田伴子，畔上二郎，安生孝子，三枝克彦
(財)食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257-8523　神奈川県秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Naoki Ohara(Study director)
Hiromasa Takashima, Hirotaka Matsumoto, Sachiko Ichihara, Hiroko Inada, Tomoko Nagata, Jiro Azegami, Takako Anjo, Katsuhiko Saegusa
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627