4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)の細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 4,4'-Isopropylidenebis(2,6-dibromophenol) on Bacteria

要約

4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)について，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537 1)およびEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用い，用量設定試験で，TA100，TA1535，TA1537のS9 mix無添加試験とTA1537のS9 mix添加試験では抗菌性を示す用量が認められたことから，本試験は用量範囲をS9 mix無添加試験では，TA1537は4.88〜156 μg/plate，TA1535は19.5〜625 μg/plate，TA100は78.1〜2500 μg/plate，TA98およびWP2 uvrAは156〜5000 μg/plateとし，S9 mix添加試験では，TA1537は19.5〜625 μg/plate，その他の検定菌は156〜5000 μg/plateとして実施した．ただし，TA1537のS9 mix添加試験では，本試験で抗菌性のない用量が4用量に満たなかったため，用量範囲を9.77〜313 μg/plateに下げて本試験Iの再試験および本試験を行った．

その結果，2回の本試験とも用いた5種類の検定菌のいずれの用量においても，陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果から4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

方法

1.　被験物質

4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)は，白色粉末である．用いた被験物質は，ロット番号8Y291G，純度99.5 %，製造 東ソー(株)(山口)であり，東ソー(株)から供与された．被験物質は，使用時まで室温で保管した．本ロットについては，試験期間中安定であることが確認された．

4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)は，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:ACQ2095およびACL5008，和光純薬工業(株))に溶解して最高用量の調製液を調製した後，同溶媒で所定の濃度に希釈して速やかに試験に用いた．

2.　陽性対照物質

用いた陽性対照物質および調製法は以下のとおりである．

各検定菌ごとに用いた陽性対照物質は，当研究所で十分な蓄積データが得られている物質および用量とし，それぞれTable中に示した．

2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF2，和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(SA，和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン(9AA, Sigma Chem. Co.)
2-アミノアントラセン(2AA，和光純薬工業(株))
AF2，9AAおよび2AAはDMSOに，SAは超純水に溶解したものを-20 ℃で凍結保存し，解凍後，速やかに試験に用いた．

3.　検定菌

Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用いた．

S. typhimuriumの4菌株は1997年8月7日に，E. coli WP2 uvrA株は1997年4月9日に日本バイオアッセイ研究センターの松島泰次郎博士から分与された．

検定菌は-80 ℃で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，膜変異(rfa)およびアンピシリン耐性因子 pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．

試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid Ltd.)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37 ℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．分光光度計により660 nmの吸光度を測定し，検定菌液の増殖を確認した．

4.　培地およびS9 mixの組成

1)　合成培地

培地は，極東製薬工業(株)製の最少グルコース寒天培地を用いた．なお，培地1 Lあたりの組成は下記のとおりである．
硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
大洋寒天(清水食品)15 g
径90 mmのシャーレ1枚あたり30 mLを流して固めたものである．

2)　トップアガー

下記の水溶液(A)および(B)または(C)を容量比10:1の割合で混合した．
(A)バクトアガー(Difco Lab.)0.6 w/v %
塩化ナトリウム0.5 w/v %
(B)Salmonella typhimurium用
L-ヒスチジン0.5 mmol/L
D-ビオチン0.5 mmol/L
(C)Escherichia coli用
L-トリプトファン0.5 mmol/L

3)　S9 mix

S9 mix 1 mLあたりの組成は下記のとおりである．
S9*0.1 mL
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコース-6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
*:7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9(キッコーマン(株))を用いた．

5.　試験方法

プレインキュベーション法3)により，S9 mix無添加試験およびS9 mix添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液0.1 mL，リン酸緩衝液0.5 mL(S9 mix添加試験においてはS9 mix 0.5 mL)，検定菌液0.1 mLを混合し，37 ℃で20分間プレインキュベーションしたのち，約45 ℃に保温したトップアガー2 mLを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとに用いたの陽性対照物質の名称および用量は各Table中に示した．同時に実施した試験については，陰性および陽性対照群を共通とした．

培養は37 ℃で48時間行い，生じた復帰変異コロニー数をコロニーアナライザーまたは目視によって算定した．被験物質に由来する沈殿の有無は，肉眼により確認した．また，抗菌性の有無については，肉眼あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌叢の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，陰性および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．

用量設定試験は1回，本試験は2回実施し，結果の再現性を確認した．また，TA1537のS9 mix添加試験については，本試験の再試験も実施した．

6.　判定基準

用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加試験あるいはS9 mix添加試験において，被験物質を含有する平板上における復帰変異コロニー数の平均値が，陰性対照値の2倍以上に増加し，その増加に再現性および用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定することとした．

結果および考察

50.0〜5000 μg/plateの範囲で公比を約3として，用量試験を実施した．その結果，S9 mix無添加試験においては，TA1537では150 μg/plate以上，TA1535では500 μg/plate以上，TA100では1500 μg/plate以上の用量で抗菌性が認められた．S9 mix添加試験においては，TA1537で500 μg/plate以上の用量で抗菌性が認められた．また，被験物質に由来する沈殿は，S9 mix無添加試験では500 μg/plate以上，S9 mix添加試験では1500 μg/plate以上の用量で認められた．

以上の結果から，本試験における最高用量は，S9 mix無添加試験では，TA1537は156 μg/plate，TA1535は625 μg/plate，TA100は2500 μg/plate，TA98およびWP2 uvrAは5000 μg/plateとした．また，S9 mix添加試験では，TA1537は625 μg/plate，その他の検定菌は5000 μg/plateとした．

上記の最高用量に基づいて，公比を2で6用量を設定して2回の本試験(本試験Iおよび本試験)を実施した(Table 1, 2)．ただし，TA1537のS9 mix添加試験では，本試験Iで抗菌性のない用量が4用量に満たなかったため，最高用量を313 μg/plateに下げて本試験Iの再試験(Table 1-3)および本試験を実施した．

その結果，すべての検定菌において，2回の試験とも陰性対照値の2倍以上となる復帰変異コロニー数の増加は認められなかった．

以上の結果に基づき，4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

なお4,4'-イソプロピリデンビス(2,6-ジブロモフェノール)は，当研究所で本試験と並行して実施したチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験では陰性であった4)．また，関連物質であるビスフェノールAについては，復帰変異試験で陰性の結果が得られている5)．

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green, “Handbook of Mutagenicity Test Procedures,” eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.
3)T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, “Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens,” eds. by K. H. Norpoth, R. C. Garner, Springer, Berlin, 1980, pp.273-285.
4)山影康次，化学物質毒性試験報告，8, 133(2001).
5)労働省労働基準局安全衛生部化学物質調査課，“労働安全衛生法有害性調査制度に基づく既存化学物質変異原性試験データ集，”日本化学物質安全・情報センター，東京，1996, pp.223-224.

連絡先
試験責任者：澁谷　徹
試験担当者：原　　巧，川上久美子，須井　哉，山本明子，三枝克彦，加藤初美
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257-8523　秦野市落合729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kumiko Kawakami, Hajime Sui, Akiko Yamamoto, Katsuhiko Saegusa, Hatsumi Kato
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai Hadano-shi, Kanagawa, 257-8523, Japan
Tel +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627