四臭化エタンのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Tetrabromoethane in Rats

要約

四臭化エタンは，難燃剤発泡スチレン，油脂，ワックスなどの溶剤，比重による選鉱，液体ケージ用剤，顕微鏡検査用試薬，触媒などに使用されている化学物質である．本物質の毒性については，マウスの単回経口LD50値が報告1)されているが，毒性学的性質の詳細は明らかにされていない．

今回，四臭化エタンについて，SD系[Crj:CD(SD)IGS]ラットを用い，0(溶媒)，6，20，60および200 mg/kg用量で，28日間反復経口投与毒性試験を実施した．動物数は1群雌雄各5匹とし，投与期間終了後屠殺群の5群，ならびに14日間回復群として対照および200 mg/kgの2群を設定した．

その結果，200 mg/kg群で雌雄に一過性の軟便が認められた．尿検査においては，200 mg/kg群で雄にpHの低下が認められた．血液学検査においては，200 mg/kg群で雌に血小板数の減少が認められた．血液生化学検査においては，20および60 mg/kg群で雌にアルブミンおよび総タンパクの増加，雄に塩素の減少，60 mg/kg群で雄にカリウムの減少，雌にA/G比およびカルシウムの増加が認められ，200 mg/kg群ではこれらの変化および総コレステロールの増加が雌雄に，γ-GTPの増加および総ビリルビンの減少が雄に認められた．剖検においては，20 mg/kg以上の群で雌雄に肝臓の大型化が認められ，肝臓重量は，20 mg/kg群の雄で相対重量，60および200 mg/kg群の雌雄で絶対および相対重量の増加が認められた．また，200 mg/kg群で腎臓の雄では相対重量，雌では絶対および相対重量の増加が認められた．病理組織学検査においては，肝臓に小葉中心性肝細胞肥大が20 mg/kg以上の群で雌雄に，甲状腺の濾胞上皮肥大が60および200 mg/kg群で雌雄に認められた．腎臓には変化は認められなかった．

回復群では，肝臓の病理組織学的変化およびこれと関連する血液生化学的変化は残るものの回復傾向にあり，その他の変化はいずれも回復することが確認された．

以上の結果から，四臭化エタンのラットへの28日間反復投与による主な毒性は，肝臓および甲状腺に対する影響で，腎臓，電解質，血液などに対する影響も認められた．無影響量は，雌雄とも6 mg/kg/dayと推定された．

方法

1.　被験物質

四臭化エタンは，油に可溶な無色または淡黄色の透明な液体である．試験には，東ソー(株)(東京)からロット番号13063(純度99.2 %)を入手し，冷暗(4 ℃)条件下で保管し，使用した．被験物質の投与液は，局方オリブ油[宮澤薬品(株)]を溶媒として，所定の投与用量になるような濃度の溶液として調製し，使用時まで冷所(4 ℃)遮光下で密栓保管し，調製後7日以内に使用した．なお，保存条件下および投与形態での被験物質は安定であることを確認した．

2.　供試動物および飼育条件

動物は，SD系'Crj:CD(SD)IGS"ラットを，日本チャールス・リバー(株)(神奈川)より搬入，雄は7日，雌は8日間検疫を兼ねて試験環境に馴化させた後，5週齢で試験に供した．1群の動物数は雌雄各5匹とし，対照群および最高用量群については別に雌雄各5匹の14日間回復群を設けた．投与開始時の体重は雄で134〜155 g，雌で121〜137 gであった．ラットは，温度22〜23 ℃，湿度56〜64 %に制御した飼育室で，金網ケージに個体別に収容し，固型飼料[ラボMRストック，日本農産工業(株)]および水を自由に摂取させて飼育した．

3.　投与量および投与方法

投与量設定試験として，1群雌雄各4匹のラットに，被験物質を0，10，20，50，100および1000 mg/kg用量で14日間反復経口投与した結果，50 mg/kg以上の群で雌雄に肝臓の絶対および相対重量の増加，さらに，100 mg/kg群では雄に軟便例ならびに赤血球数，血色素量，網状赤血球数および腎臓相対重量の増加，雌に血清総タンパクの増加が認められた．200 mg/kg群では，雌雄に軟便例，赤血球数，血色素量およびヘマトクリット血の減少，網状赤血球数，血清総タンパク，総コレステロール，トリグリセライドおよび腎臓相対重量の増加，雄に腹位膨満例が認められた．したがって，本試験における投与量は，200 mg/kg/dayを最高用量とし，以下60，20，および6 mg/kg/dayの4用量を設定した．投与方法は，投与液量を体重1 kg当たり5 mLとし，テフロン製胃ゾンデを装着した注射筒を用いて1日1回(午前中)，28日間にわたって経口投与した．対照群には，局方オリブ油を同様に投与した．

4.　観察および検査

1)　一般状態観察

28日間の投与期間およびそれに続く14日間の回復期間を通じて，動物の生死，外観，行動等を毎日観察した．

2)　体重および摂餌量測定

体重は，週2回，3あるいは4日ごとに，および屠殺日に測定した．摂餌量は，毎週1回，1日(24時間)の飼料消費量を測定した．

3)　尿検査

雄は投与22，23日および投与期間終了後12，13日，雌は投与26，27日および投与期間終了後11，12日に，動物を個体別に代謝ケージに収容して約3時間蓄尿を採取し，外観の観察およびpH，潜血，タンパク，糖，ケトン体，ビリルビン，ウロビリノーゲン(以上，試験紙法:マイルス・三共(株)，マルティスティックス®)を，さらに約18時間の蓄尿により，尿量および比重の測定(屈折計:エルマ光学(株))を行った．

4)　血液学検査

採血は，投与期間および回復期間終了翌日にエーテル麻酔下で開腹して腹大動脈より行なった．動物は採血前日の午後5時から除餌し，水のみを給与した．採取した血液は3分割し，その一部は，EDTA-2Kで凝固防止処理し，多項目自動血球計数装置[東亜医用電子(株)，E- 4000]により，赤血球数(電気抵抗検出方式)，血色素量(ラウリル硫酸ナトリウム-ヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(パルス検出方式)，平均赤血球容積(MCV)，平均赤血球血色素量(MCH)，平均赤血球血色素濃度(MCHC，以上計算値)，白血球数および血小板数(以上，電気抵抗検出方式)を，また塗抹標本を作製して網状赤血球数(Brilliant cresyl blueで染色して鏡検)および白血球百分率(May-Giemsaで染色して鏡検)を測定した．また一部は，3.8 %クエン酸ナトリウム液で凝固阻止処理して血漿を分離し，血液凝固自動測定装置(アメルング社，KC-10A)により，プロトロンビン時間(PT，Quick一段法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT，エラジン酸活性化法)を測定した．

5)　血液生化学検査

採取した血液の一部から血清を分離し，生化学自動分析装置[日本電子(株)，JCA-BM8]により，総タンパク(Biuret法)，アルブミン(BCG法)，A/G比(計算値)，グルコース，トリグリセライド，総コレステロール(以上，酵素法)，総ビリルビン(ジアゾ法)，尿素窒素(Urease-UV法)，クレアチニン(Jaff法)，GOT，GPT，γ-GTP，ALP(以上，JSCC法)，LDH(SFBC法)，コリンエステラーゼ(BTC-DTNB法)，カルシウム(OCPC法)および無機リン(酵素法)を，また電解質自動分析装置[東亜電波工業(株)，NAKL-132]により，ナトリウムおよびカリウムを測定した．塩素は高速液体クロマトグラフシステム[島津製作所(株)，LC-10Aイナーイト]を用いてイオンクロマトグラフ法で測定した．

6)　病理学検査

投与期間あるいは回復期間終了翌日の採血に続いて放血屠殺して剖検した．また，脳，心臓，胸腺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，精巣，精巣上体および卵巣，子宮を秤量(絶対重量)し，また対体重比(相対重量)を算出した．病理組織学検査は，採取した器官を10 %中性リン酸緩衝ホルマリン液(精巣および精巣上体のみブアン液で固定)で固定後，対照群および200 mg/kg群については，脳，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，胸腺，心臓，肺，気管，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，胃，腸，膀胱，脊髄，リンパ節，坐骨神経，骨髄，さらに雄では精巣，精巣上体，前立腺，雌では卵巣，子宮を検査した．また，200 mg/kg群では雌雄で肝臓と甲状腺に病理組織学的変化が認められたので，雌雄の肝臓および甲状腺については6，20および60 mg/kg群ならびに回復群も検査した．検査は，常法によりパラフィン切片を作製し，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して鏡検した．

5.　統計解析

パラメトリックデータについては，Bartlettの分散検定を行い，分散が一様な場合は一元配置の分散分析を行った．分散が一様でない場合およびノンパラメトリックデータはKruskal-Wallisの順位検定を行った．それらの結果，有意差を認めた場合，DunnettまたはSheff群間で標本数が異なる場合)の方法により対照群に対する各群の比較検定を行った．カテゴリカルデータにはFisherの直接確率法を用いた．有意水準は，いずれの場合も5 %とした．

結果

1.　死亡および一般状態

投与期間において，軽度な軟便が200 mg/kg群で雌雄各10匹中，雄の3匹および雌の2匹に一過性に認められた．

2.　体重(Fig. 1)

投与期間において，雌雄とも各測定時点の体重および投与期間中の体重増加量に有意な変化は認められなかった．回復期間においては，回復群の体重増加量は雌雄とも対照群に比べて有意に低値であったが，各測定時点における体重には有意差は認められなかった．

3.　摂餌量

投与期間において，200 mg/kg群で雄の投与2週における摂餌量に有意な高値が認められたが，体重に関連した変化はなく，偶発的な所見と判断された．

回復期間において，雌の200 mg/kg群の摂餌量が低値傾向にあったものの，有意な変化ではなかった．

4.　尿検査(Table 1)

投与期間中の検査において，200 mg/kg群で雄にpHの有意な低下が認められ，雌においても同様な傾向が認められた．

回復期間中の検査において，各検査項目に変化は認められなかった．

5.　血液学検査(Table 2)

投与期間終了時の検査において，200 mg/kg群で雌に血小板数の有意な減少が認められた．なお，同群の雌に平均赤血球血色素濃度の有意な減少が認められたが，正常範囲内の変動で，血色素およびヘマトクリット値には有意な変化は認められなかった．

回復期間終了時の検査において，雄にヘマトクリット値の減少，雌に白血球数の減少およびプロトロンビン時間の短縮が認められたが，これらはいずれも投与期間終了時の検査では認められなかった変化であり，偶発的な所見と判断された．

6.　血液生化学検査(Table 3)

投与期間終了時の検査において，20および60 mg/kg群の雌と200 mg/kg群の雌雄に総タンパクおよびアルブミンの有意な増加が認められ，60 mg/kg群の雌および200 mg/kg群の雌雄でA/G比が有意な高値を示した．また，20および60 mg/kg群の雄と200 mg/kg群の雌雄に塩素の有意な減少が認められた．さらに，60 mg/kg群の雄と200 mg/kg群の雌雄にカリウムの有意な減少，60 mg/kg群の雌と200 mg/kg群の雌雄にカルシウムの有意な増加が認められた．これらの変化に加えて，200 mg/kg群の雌雄に総コレステロールの有意な増加，雄にγ-GTPの有意な増加および総ビリルビンの有意な減少が認められた．

回復期間終了時の検査において，雌雄の総タンパクの増加，雄の総ビリルビンの減少および雌の総コレステロールの増加に有意差が残るものの，総タンパクおよび総コレステロールの変化は軽減する傾向にあった．雌雄のγ-GTPは有意な減少および雄のカリウムは有意な増加を示したが，これは投与期間終了時とは逆の変化であった．

7.　剖検

投与期間終了時において，肝臓の大型化が20 mg/kg群で雄1匹，雌1匹，60 mg/kg群で雄1匹，雌2匹および200 mg/kg群で雄4匹，雌5匹に認められた．200 mg/kg群の雌雄の発現率は対照群と比べて有意差が認められた．なお，精巣および精巣上体の小型化が200 mg/kg群の雄に認められたが，1匹のみの変化であった．

回復期間終了時においては，肝臓の大型化が雄の3匹，雌の2匹に認められた．

8.　器官重量(Table 4)

投与期間終了時において，20 mg/kg群の雄に肝臓の相対重量の有意な増加が認められ，雌雄の肝臓の絶対重量および雌の相対重量も増加傾向にあった．60および200 mg/kg群では，雌雄に肝臓の絶対および相対重量の有意な増加が認められた．さらに，200 mg/kg群の腎臓で，雄は相対重量に，雌では絶対および相対重量に有意な増加が認められた．また，雌雄の甲状腺の絶対および相対重量に増加傾向が認められた．

回復期間終了時の検査では，投与期間終了時で認められた変化のうち，肝臓は雌雄とも相対重量に有意差が残るものの変化の程度は軽減する傾向にあり，腎臓には有意な変化は認められなかった．雌雄の甲状腺の絶対および相対重量の増加傾向は回復群においても残存し，雌の相対重量には有意差が認められた．

なお，回復群において，雌で最終体重の低値傾向がみられ，あわせて脾臓の絶対重量の有意な減少ならびに心臓および副腎の相対重量の有意な増加が認められた．

9.　病理組織学検査(Tables 5, 6)

投与期間終了時において，肝臓では小葉中心性の肝細胞肥大が20 mg/kg群で雄3匹，雌3匹，60 mg/kg群で雄4匹，雌5匹および200 mg/kg群で雌雄とも5匹に認められ，60および200 mg/kg群の雌雄の発現率には，対照群と比べて有意差が認められた．なお，雄の肝臓において，巣状壊死が対照群で2匹，6 mg/kg群で1匹，20 mg/kg群で3匹および60 mg/kg群で1匹に認められたのに対し，200 mg/kgでは5匹に認められた．また，雌の肝臓では200 mg/kg群の1匹にのみ巣状壊死が認められた．しかしながら，雌雄とも200 mg/kg群の発現率は対照群と比べて有意差は認められなかった．甲状腺では濾胞上皮の肥大が60 mg/kg群で雄1匹，雌2匹，200 mg/kg群で雄4匹，雌5匹に認められ，濾胞はやや小型化し，コロイドは減少する傾向にあった．その発現率は，200 mg/kg群で対照群と比べて有意差が認められた．

回復期間終了時において，200 mg/kg群で肝臓の肝細胞肥大が雄の3匹および雌の2匹に認められたが，投与期間終了時と比べて，発現率および変化の程度は軽減する傾向にあった．

以上の変化以外にも，投与期間終了時屠殺動物の検査した各器官に変化が認められたが，散発的あるいは用量相関の認められない所見であった．

考察

四臭化エタンのラットへの28日間反復経口投与において，肝臓，甲状腺，腎臓，電解質，血液などに対する影響を示唆する変化が認められた．

肝臓に対する影響としては，肝臓重量の増加傾向が20 mg/kg以上の群の雌雄に用量相関的に認められ，病理組織学的には小葉中心性の肝細胞肥大が認められた．肝機能と関連する血液生化学的変化として，20 mg/kg以上の群の雌および200 mg/kg群の雄にアルブミンの増加が認められ，総タンパクおよびA/G比は高値を示した．200 mg/kg群でみられた雌雄の総コレステロールの有意な増加，雄のγ-GTPの有意な増加についても，肝臓に対する影響と関連した変化である可能性が考えられる．なお，肝臓の巣状壊死が雄の各群に認められ，200 mg/kg群では増加傾向にあり，雌では200 mg/kg群にのみ1例の発現が認められた．しかしながら，この変化はラットの肝臓に自然発生病変として一般的に認められる変化で，対照群の発現率との間に統計学的有意差が認められないことから，被験物質の投与による変化ではないと判断された．したがって，四臭化エタンの肝臓に対する影響は，主にアルブミンの増加を伴った肝細胞の肥大で，酵素誘導を惹起する物質の投与により発現する機能亢進性の変化1)と同質のものと考えられた．四臭化エタンの毒性について，ラットへの106日間反復吸入投与により，肝臓重量の増加が認められたとの報告2)があるが，経口投与による本試験においても，肝臓に対する影響が確認された．

甲状腺に対する影響について，病理組織学的検査で濾胞上皮の軽度な肥大が雌雄の60 mg/kg以上の群で認められ，200 mg/kg群の雌雄の甲状腺重量は増加傾向を示した．化学物質の投与による濾胞上皮の肥大はほとんどが循環血中の甲状腺ホルモンの低下によるnegative-feedback機構が関与した，持続性の濾胞上皮の刺激が原因となり，その作用機序として肝臓での甲状腺ホルモンの代謝・分解の亢進が報告3, 4)されている．したがって，本物質による甲状腺の変化は，肝臓に対する影響と関連した変化である可能性も考えられる．

腎臓に対する影響について，200 mg/kg群の雌雄で腎臓相対重量の増加が認められ，雌では絶対重量も高値を示した．しかしながら，腎臓の病理組織学的変化は認められず，また，腎機能と関連した血液生化学的変化も認められなかった．したがって，本物質の腎臓に対する影響は軽度なものと考えられる．

電解質に対する影響について，塩素の減少が20と60 mg/kg群の雄および200 mg/kg群の雌雄，カリウムの減少が60 mg/kg群の雄および200 mg/kg群の雌雄，ならびにカルシウムの増加が60 mg/kg群の雌および200 mg/kg群の雌雄に認められ，塩素の変化は顕著なものであった．臭素化合物を投与した動物の塩素について，これを一般的なイオン電極法で測定すると，生体内で解離した臭素イオンが加算されて測定されるため塩素は高値を示すことが多く5, 6)，本物質についてもイオン電極法を用いて測定した14日間の投与量設定試験の結果では塩素は用量相関的に高値を示し，被験物質に由来する臭素イオンの存在が示唆された．一方，本試験では，特異性の高いイオンクロマトグラフ法で測定した結果，塩素の低値が認められた．腎臓の尿細管における物質の再吸収において，塩素イオンと臭素イオンは競合し，血中に臭素イオンが増加すると塩素イオンの排泄が促進され，塩素イオンは減少することが知られている7)．したがって，塩素の低値は，被験物質の腎臓に対する毒性影響と関連した変化ではないと判断された．

血液に対する影響について，200 mg/kg群で雌に血小板数の減少が認められた．しかしながら，骨髄および脾臓の造血細胞に病理組織学的変化が認められなかった．

回復群においては，被験物質の投与と関連した変化のうち，肝臓における重量変化および病理組織学的変化ならびに肝機能と関連すると思われるアルブミンの変化は雌雄に，総コレステロールの変化は雌に残存していたが，変化の程度は軽減し，回復傾向が認められた．雌で甲状腺の相対重量の増加が認められたが，関連する病理組織学的変化は認められなかった．

以上の結果から，四臭化エタンのラットへの28日間反復投与による主な毒性として，肝臓，甲状腺，腎臓，電解質，血液に対する影響が認められた．無影響量は雌雄とも6 mg/kg/dayと推定された．

文献

1)T. Wakabayashi, et al., Exp. Mol. Pathol., 31, 387(1979).
2)R. L. Hollingsworth, et al., Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 24, 28(1963).
3)C. C. Capen, et al., Toxicol. Pathol., 17, 266(1989).
4)P. F. Smith, et al., Toxicol. Pathol., 19, 197(1991).
5)Y. Ito, et al., Tox. Test. Rep. Envilon. Chem., 2, 357(1995).
6)H. Hiratuka et al., Tox. Test. Rep. Envilon. Chem., 4, 81(1996).
7)上條一也，大森義仁，高木敬次郎，藤原元始，吉利和監訳，"Goodman Gilman薬理書(上)薬物治療の基礎と臨床，第5版，"廣川書店，東京，1980, p.151.

連絡先
試験責任者：伊藤義彦
試験担当者：野田　篤，山口真樹子，伊藤雅也，赤木　博
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Yoshihiko Ito(Study director)
Atushi Noda, Makiko Yamaguchi, Masaya Ito, Hiroshi Akagi
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, Kanagawa, 229-1132, Japan
Tel +81-042-762-2775Fax +81-042-762-7979