2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)の細菌を用いる
復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile) on Bacteria

要約

2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)について，細菌を用いる復帰突然変異試験を実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537 1)および Escherichia coli WP2 uvrA 2,3)の5菌株を用い，S9 mix 無添加および添加試験のいずれも用量設定試験において，すべての検定菌において抗菌性は認められなかったことから，本試験では S9 mix 無添加試験および添加試験を 313〜5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して実施した．

その結果，TA1537 の S9 mix 添加試験およびその他の検定菌においては，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．TA1537の S9 mix 無添加試験では，2回の本試験でともに変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上となる用量が認められたが，変異コロニー数の偶発的な増加の可能性が考えられたため，等差により 225〜625 μg/プレートの範囲で再現性試験を実施したが，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．

TA1537 の S9 mix 無添加試験では，明確な結論が得られなかったため， TA1537 および TA97 を国立衛生試験所から分与を受けて，313〜5000 μg/プレートの範囲で用量を設定して2回の追加試験を行った．その結果，いずれの検定菌においても溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．これらのことから，TA1537 のS9 mix 無添加試験においては変異原性が認められないものと考えられる．

以上の結果から，2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)は，用いた試験系において変異原性を有しない(陰性)と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100
Salmonella typhimurium TA1535
Escherichia coli WP2 uvrA
Salmonella typhimurium TA98
Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimurium の4菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB.N. Ames 博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

ただし，TA1537 の S9 mix 無添加試験では，明確な結論が得られなかったため，TA1537(以下 TA1537E)および TA1537 と検出し得る変異原物質が類似している S. typhimurium の TA97 を，1996年9月25日に国立衛生試験所の能美健彦博士から分与を受けて追加試験を行った．

検定菌は-80℃以下で凍結保存したものを用い，各菌株の特性確認は，凍結保存菌の調製時に，アミノ酸要求性，UV感受性，および膜変異(rfa)とアンピシリン耐性因子 pKM 101(プラスミド)の有無について調べ，特性が維持されていることを確認した．試験に際して，ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間〜12時間10分往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(CAS No. 78-67-1)は，分子量 164.24の白色結晶である．用いた被験物質は，ロット番号 5H96A，純度 99.9 wt%(不純物:0.1％ 水，メタノール)であり，大塚化学(株)から供与された．被験物質は，使用時まで遮光して冷蔵した．

2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)は，ジメチルスルホキシド(DMSO，ロット番号:ESK4546，和光純薬工業(株))に溶解して最高濃度の調製液を調製した後，同溶媒で公比約3ないし2で希釈し，速やかに試験に用いた．ただし，再現性試験においては，等差になるように希釈を行った．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．
AF2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(上野製薬(株))
SA:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9AA:9-アミノアクリジン(Sigma Chem. Co.)
2AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
AF2 および 2AA は DMSO に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAは DMSO に，SA は純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9 mix の組成〕

1)　トップアガー(TA菌株用)

下記の水溶液(A)および(B)を容量比 10:1 の割合で混合した．

(A)バクトアガー(Difco)0.6 ％
塩化ナトリウム0.5 ％
(B)*L-ヒスチジン0.5 mM
D-ビオチン0.5 mM
*:WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，極東製薬工業(株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 l あたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g
クエン酸・1水和物2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
バクトアガー(Difco)15 g

径 90 mm のシャーレ1枚あたり 30 ml を流して固めてある．

**:HY2101 では，大洋寒天(清水食品)を使用．

3)　S9 mix

1 ml中下記の成分を含む

S9***0.1 ml
塩化マグネシウム8 μmol
塩化カリウム33 μmol
グルコース-6-リン酸5 μmol
NADH4 μmol
NADPH4 μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
***:7週齢の Sprague-Dawley 系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および 5, 6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレインキュベーション法 4)により，S9 mix 無添加試験および S9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix 添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液 0.1 ml を混合し，37℃で20分間往復振とう培養したのち，トップアガー2 mlを加えて混和し，合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりに使用溶媒，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した．なお，溶媒および陽性対照群は，同時に実施した他の試験と共通とした．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験および再現性試験においては，両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った．また，TA1537 の S9 mix 無添加試験については，変異コロニー数増加の再現性と用量依存性を確認するために，再現性試験を行った．更に，追加試験として，TA1537E と TA97 の S9 mix 無添加試験について，1回の用量設定試験と2回の本試験を実施した．

〔判定基準〕

用いた5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌の S9 mix 無添加あるいは S9 mix 添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．ただし，2回の本試験の一方でのみ変異コロニー数の平均値が溶媒対照値の2倍以上となる用量が認められた場合において，その溶媒対照値が10以下であり，変異コロニー数の増加に用量依存性が認められない場合は陰性とすることとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)について 50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施した．その結果，すべての検定菌の S9 mix 無添加試験および添加試験のいずれにおいても抗菌性は認められなかった．

したがって，本試験における最高用量は，S9 mix 無添加試験および添加試験とも 5000 μg/プレートとした．

〔本試験〕

S9 mix 無添加試験および添加試験でともに，313〜5000 μg/プレートの範囲で公比を2として2回の本試験を実施した(Table 1，2)．その結果，TA1537 の S9 mix 添加試験と，その他の検定菌においては，2回の本試験とも溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．一方，TA1537 の S9 mix 無添加試験においては，本試験Iの 625 μg/プレートと本試験IIの 313，625，1250 および 5000 μg/プレートで，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数を示したが，溶媒対照値はいずれも10以下であり，用量依存性も認められなかった．

〔再現性試験〕

TA1537 の S9 mix 無添加試験においては，2回の本試験でともに 625 μg/プレートの変異コロニー数が溶媒対照値の2倍以上となったが，それらの溶媒対照値はいずれも10以下と低く，2回の本試験で認められた変異コロニー数は，いずれも溶媒対照値の蓄積データの範囲内であり，用量依存性も認められなかったことから，変異コロニー数が偶発的に溶媒対照値の2倍を超えた可能性が考えられた．そこで，225〜625 μg/プレートの用量範囲で，等差によりで5用量を設定して，再現性試験を実施した(Table 3)．その結果，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められず，用量依存性もみられなかった．

〔追加試験〕

TA1537 の S9 mix 無添加試験については，明確な結論が得られなかったため，TA1537E および TA97 を用いて，S9 mix 無添加の条件で追加試験を行った．まず，50〜5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，用量設定試験を実施した結果，いずれの検定菌においても抗菌性は認められなかった．この結果に基づいて，313〜5000 μg/プレートの範囲で公比を2として2回の本試験を実施した(Table 4，5)．その結果，いずれの検定菌においても溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．再現性試験と追加試験の結果から，当該被験物質は S9 mix 無添加の条件で，TA1537および TA97 に対して変異原性を示さないものと考えられる．

以上の結果に基づき，2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)は，用いた試験系において変異原性を有しないもの(陰性)と判定した．

文献

1)D.M. Maron, B.N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)S. Venitt, C. Crofton-Sleigh, "Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens," eds. by F.J. de Serres, J. Ashby, Elsevier/North-Holland, New York, 1981, pp. 351-360.
3)M.H.L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.
4)T. Matsushima, T. Sugimura, M. Nagao, T. Yahagi, A. Shirai, M. Sawamura, "Short-Term Test Systems for Detecting Carcinogens," eds. by K.H. Norpoth, R.C. Garner, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1980, pp. 273-285.

連絡先：
試験責任者澁谷　徹
試験担当者原　　巧，坂本京子，堀谷尚古，
川上久美子，笠間菊子，宮田美穂子
(財)食品薬品安全センター　秦野研究所
〒257 神奈川県秦野市落合 729-5
Tel 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Tohru Shibuya(Study Director)
Takumi Hara, Kyoko Sakamoto,
Naoko Horiya, Kumiko Kawakami,
Kikuko Kasama, Mihoko, Miyata
Hatano Research Institute，Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai，Hadano-shi，Kanagawa 257 Japan
Tel +81-463-82-4751FAX +81-463-82-9627