ジシクロペンタジエンの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験
InVitro Chromosomal Aberration Test of
Dicyclopentadiene on Cultured Chinese Hamster Cells
要約
OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，ジシクロペンタジエンの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響を評価するため，チャイニーズ・ハムスター培養細胞 (CHL/IU) を用いて試験管内染色体異常試験を実施した．
連続処理（24および48時間），短時間処理（6時間）のS9 mix非存在下においては，50%を越える増殖抑制濃度， すなわち0.057 mg/mlの濃度を最高処理濃度とした．また，短時間処理のS9 mix存在下では，50%を越える増殖抑制濃度， すなわち0.10 mg/mlの濃度を最高処理濃度とした．最高処理濃度の1/2および1/4を，それぞれ中濃度および低濃度として設定した．連続処理ではS9 mix非存在下における24時間および48時間連続処理後，短時間処理ではS9 mix存在下および非存在下で6時間処理（18時間の回復時間）後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．
CHL/IU細胞を24時間連続処理した高濃度群 (0.057 mg/ml) において，観察した細胞の8.1%（gapを含む）に染色体の構造異常が誘発され，疑陽性の結果が得られた．そこで，染色体異常誘発を精度よく反映できるin vitro小核試験による追加試験を実施したところ，24時間連続処理したいずれの処理群においても，小核の有意な増加は認められず，染色体異常誘発性に関して，再現性が得られなかった．一方，48時間連続処理した低濃度群 (0.014 mg/ml) において，染色体の構造異常の有意な増加が認められたが，生物学的には陰性と判定した．その他の処理群においては，染色体の構造異常および倍数性細胞の有意な増加は認められなかった．短時間処理では，S9 mix存在下および非存在下で6時間処理したすべての処理群において，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．
以上の結果より，ジシクロペンタジエンは，上記の試験条件下で，試験管内のCHL/IU細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．
方法
1. 使用した細胞
リサーチ・リソースバンク (JCRB) から入手（1988年2月，入手時：継代 4代，現在12代）したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU細胞を，解凍後継代10代以内で試験に用いた．
2. 培養液の調製
培養には，牛胎児血清（FCS：JRH BIOSCIENCESおよびBiocell）を10%添加したイーグルMEM（日水製薬(株)）培養液を用いた．
3. 培養条件
2×10^4個のCHL/IU細胞を，培養液5 mlを入れたディッシュ（径6 cm，Corning）に播き，37 ℃のCO2インキュベーター (5% CO2 ) 内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後新鮮な培養液でさらに18時間培養した．
4. 被験物質
ジシクロペンタジエン（略号：DCP, CAS No.：77-73-6，ロット番号：D93028，日本ゼオン(株)製造，(社)日本化学工業協会提供）は，無色の液体で，水およびジメチルスルホキシドに不溶，アセトンに可溶，融点32.9℃，沸点166.6℃，蒸気圧10 mmHg (47.6℃)，分子式C10H12，分子量132.22，純度95%の物質である．被験物質原体の安定性に関する情報は得られなかったが，加熱（約150℃）により分解・重合する．また，溶媒中（アセトン）では，2.85〜20.0 mg/mlの濃度範囲で4時間は安定であった．
5. 被験物質の調製
被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒はアセトン（和光純薬工業(株)）を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の0.5% (v/v) になるように加えた．染色体異常試験および小核試験に用いた被験物質調製液の濃度は，許容範囲内（溶媒中での平均含量が添加量の90.0〜110%）の値であった．なお，濃度の記載について，純度換算は行なわなかった．
6. 細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定
染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質のCHL/IU細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計（MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株)）を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．
その結果，連続処理における50%の増殖抑制濃度を明らかに越える濃度（約60%の増殖抑制濃度）は，60%の増殖抑制濃度をはさむ2濃度の値より算出したところ，0.056 mg/mlであった．一方，短時間処理のS9 mix存在下および非存在下では，それぞれ0.10 mg/mlおよび0.057 mg/mlであった (Fig. 1, 2)．
7. 実験群の設定
細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理および短時間処理のS9 mix非存在下では0.057 mg/ml，短時間処理のS9 mix存在下では0.10 mg/mlとし，それぞれ高濃度群の1/2の濃度を中濃度，1/4の濃度を低濃度とした．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC（MC，協和醗酵工業(株)）および シクロホスファミド (CPA，Sigma Chemical Co.) は，注射用水（(株)大塚製薬工場）に溶解して調製した．それぞれ染色体異常および小核を誘発することが知られている濃度を適用した．
8. 染色体標本作製法
培養終了の2時間前に，コルセミドを最終濃度が約0.1 μg/mlになるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は，各ディッシュにつき 6枚作製した．作製した標本を3%ギムザ液で染色した．
9. 染色体分析
作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験 (MMS) 分科会1）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞 (polyploid) の有無について観察した．また構造異常については， 1群200個，倍数性細胞については 1群800個の分裂中期細胞を分析することとした．
10. 小核標本作製法
ディッシュより細胞を剥離し，遠心して得られた細胞に3 mlの0.15 M KCl水溶液を加え，約20分間低張処理した．メタノール：氷酢酸 (5:1) で細胞を固定し，数回の固定操作の後，新たに少量の固定液を加えて細胞を浮遊させた．少量の細胞懸濁液をとり，スライド上に1滴滴下した．作製した標本を3%ギムザ液で染色した．
11. 小核標本の観察法
作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，二名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．観察は，60倍以上の対物レンズ（接眼 10倍）をつけた顕微鏡を用いて行った．細胞質を含み，細胞質周辺の明瞭な間期細胞1000個について観察し，小核（直径が主核の1/3以下であり，色調により明らかに核由来と判定できるもの2））をもった細胞を算定した．
12. 記録と判定
無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．染色体異常を有する細胞の出現頻度について，フィッシャーのexact probability test法により，溶媒対照群と被験物質処理群間および溶媒対照群と陽性対照群間の有意差検定 (p<0.05) を行った．被験物質の染色体異常誘発性についての最終判定は，石館ら3）の判定基準に従い，染色体異常を有する細胞の頻度が5%未満を陰性，5%以上10%未満を疑陽性，10%以上を陽性とした．但し，疑陽性の結果が得られた群については，小核試験により，再現性，用量依存性等を検討し最終判定を行うこととした．小核試験に関しては，Kastenbaum & Bowmanの方法 (1970) 4）に従って有意差検定 (p<0.05) を行い，小核誘発の判定を行った．
結果および考察
連続処理による染色体分析の結果をTable 1に示した．
ジシクロペンタジエンを加えて24時間連続処理した高濃度群 (0.057 mg/ml) で，観察した細胞の8.1%（gapを含む）に染色体の構造異常が誘発され，疑陽性の結果が得られた．そこで，再現性確認のための追加試験として，染色体の構造異常を精度よく反映することができるin vitro小核試験を実施した (Table 2)．その結果，24時間連続処理したいずれの処理群においても，小核の有意な増加は認められず，染色体異常誘発性に関して，再現性は得られなかった．一方，48時間連続処理した低濃度群 (0.014 mg/ml) において，染色体の構造異常の有意な増加 (p=0.0304) が認められたが，生物学的には陰性と判定した．その他の処理群においては，染色体の構造異常および倍数性細胞の有意な増加は認められなかった．
短時間処理による染色体分析の結果をTable 3に示した．
ジシクロペンタジエンを加えて，S9 mix存在下および非存在下で 6時間処理したすべての処理群で，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．
従って，ジシクロペンタジエンは，上記の試験条件下で，試験管内のCHL/IU細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．
文献
| 1) | 日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編, "化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店, 1988. |
| 2) | 日本組織培養学会編, "細胞トキシコロジー試験法," 朝倉書店, 1991, pp. 247-251. |
| 3) | 石館 基 監修, "〈改訂〉染色体異常試験データ集," エル・アイ・シー社, 1987. |
| 4) | M.A. Kastenbaum, K.O. Bowman, Mutation. Res., 9, 527-549, (1970). |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 田中憲穂 |
| 試験担当者： | 山影康次，若栗 忍，中川ゆづき，日下部博一，橋本恵子 |
| (財)食品薬品安全センター秦野研究所 |
| 〒257 神奈川県秦野市落合729-5 |
| Tel. 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | |
| Correspondence |
| Authors: | Noriho Tanaka ( Study director )
Kohji Yamakage, Shinobu Wakuri,
Yuzuki Nakagawa, Hirokazu Kusakabe,
Keiko Hashimoto |
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center |
| 729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257, Japan |
| Tel. +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | |