3,4-ジクロロ-1-ブテンの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of 3,4-Dichloro-1-butene on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性調査事業の一環として，3,4-ジクロロ-1-ブテンについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施し，陽性の結果を得た．

検定菌として， Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrA の5菌株を用い，S9 mix無添加および添加の条件でプレート法により，用量設定試験を50～5000 μg/プレートの用量で行ったところ，S9 mix無添加試験およびS9 mix無添加試験のいずれにおいても，1500あるいは5000 μg/プレートの用量で抗菌性が認められた．またTA100およびTA1535 についてはS9 mix無添加，添加のいずれの条件においても，変異コロニー数が増加する傾向にあった．そこで，本試験での最高用量をS9 mix無添加，添加のいずれの条件についても2500 μg/プレート(S9 mix添加のTA100およびTA98のみそれぞれ3000 μg/プレートおよび5000 μg/プレート)とし，TA100とTA1535の2菌株は等差で，その他の3菌株は公比2で用量を設定した．しかし1回目の本試験において用量設定試験よりもさらに低い濃度において抗菌性が認められた菌株が多かったため，最高用量をさらに1～2段階低くして，いずれの菌株においても再現性の確認ができるまで試験を行った．

その結果， S9 mix無添加試験では，TA98と TA1537 は 625 μg/プレート，TA100は850 μg/プレート，TA1535は1000 μg/プレート，さらにWP2 uvrA は1250 μg/プレートの用量で，S9 mix添加試験では，TA98，TA1537およびWP2 uvrAは1250 μg/プレート，TA1535は2000 μg/プレート，TA100 で 2200 μg/プレートの用量で抗菌性が認められた．復帰変異コロニー数については，用いた5種類の検定菌のうち，TA1535のS9 mix無添加，添加試験のいずれも溶媒対照値の2倍以上となる用量依存性のある復帰変異コロニー数の増加が認められ，再現性も確認されたことから，3,4-ジクロロ-1-ブテンは，用いた試験系において変異原性を有する(陽性)と判定された．

試験方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの4菌株1)は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA 株2)は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．

検定菌は－ 80℃以下で凍結保存したものを用い，各ニュートリエントブロスNo. 2(Oxoid)を入れたL字型試験管に解凍した種菌を一定量接種し，37℃で10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

3,4-ジクロロ-1-ブテン(CAS No. 760-23-6)は，分子量 124.99 の無色透明(購入時は淡黄色)の液体である．試験には，東京化成工業(株)製〔ロット番号：FBP01，純度 99％(不純物：不明)〕のものを購入し，使用時まで冷蔵保管し，用いた．

3,4-ジクロロ-1-ブテンは，アセトンに溶解性がよいことから，アセトンに50 mg/mlとなるよう溶解した後，同溶媒で公比約3ないし2あるいは等差で希釈し，速やかに試験に用いた．

試験の開始に先立って， 3,4-ジクロロ-1-ブテンのアセトン溶液中での安定性試験および含量測定試験を実施した．安定性試験においては，低濃度(0.500 mg/ml)溶液は染色体異常試験で調製したものについて，また高濃度(50.0 mg/ml)溶液は当該試験の本試験Ⅰで調製したものについて，室温遮光条件下で，安定性を調べた．その結果，調製4時間後における各濃度の平均含量は，それぞれ初期値(0時間)の平均値に対して，105 および 100％であった．

また，含量測定試験を行った結果，調製液の濃度は，低濃度 (1.56 mg/ml)溶液は，98.8％，高濃度(50.0 mg/ml)溶液は98.7％であった．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF-2	：	2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド	（上野製薬（株））
SA	：	アジ化ナトリウム	（和光純薬工業（株））
9-AA	：	9-アミノアクリジン	（Sigma Chem.Co.）
2-AA	：	2-アミノアントラセン	（和光純薬工業（株））

AF2, 2AAはDMSO(和光純薬工業(株))に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9AAはDMSOに，SAは純水に溶解し，速やかに試験に用いた．

〔培地および S9混液の組成〕

1)　トップアガー

下記の水溶液 (A)および(B)を容量比10:1の割合で混合した．

（A）	バクトアガー（Difco）	0.6％
	塩化ナトリウム	0.5％
（B）*	L-ヒスチジン	0.5mＭ
	ビオチン	0.5mＭ

*:	WP2 uvrA 用には，0.5 mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)　合成培地

培地は，日清製粉 (株)製の最少寒天培地を用いた．なお，培地1 lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2g
クエン酸・1水和物	2g
リン酸水素二カリウム	10g
リン酸一アンモニウム	1.92g
水酸化ナトリウム	0.66g
グルコース	20g
バクトアガー(Difco)	15g

径 90 mmのシャーレ1枚あたり30 mlを流して固めてある．

3)　S9 mix

1ml中下記の成分を含む

S9**	0.1ml
塩化マグネシウム	8μmol
塩化カリウム	33μmol
グルコース-6-リン酸	5μmol
NADH	4μmol
NADPH	4μmol
ナトリウム-リン酸緩衝液(pH7.4)	100μmol

**:	7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール(PB)および5,6-ベンゾフラボン(BF)の併用投与で酵素誘導して作製したS9を用いた．

〔試験方法〕

プレート法により， S9 mix無添加試験およびS9 mix 添加試験を行った．

小試験管中に，被験物質調製液 0.1 ml，リン酸緩衝液 0.5 ml(S9 mix添加試験においては S9 mix 0.5 ml)，検定菌液 0.1 mlおよびトップアガー2 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は各Table 中に示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定した．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．

用いた平板は用量設定試験においては，溶媒および陽性対照群では 3枚ずつ，各用量については1枚ずつとした．また，本試験においては両対照群および各用量につき，3枚ずつを用い，それぞれの平均値と標準偏差を求めた．用量設定試験は1回，本試験は同一用量について2回実施し，結果の再現性の確認を行った

〔判定基準〕

用いた 5種の検定菌のうち，1種以上の検定菌のS9 mix無添加あるいはS9 mix添加条件において，被験物質を含有する平板上における変異コロニー数の平均値が，溶媒対照のそれに比べて2倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する(陽性)と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

50～5000 μg/プレートの範囲で公比を約3として，試験を実施したところ，S9 mix無添加試験ではWP2 uvrA，TA1537が1500 μg/プレート以上で，その他は 5000 μg/プレートで，またS9 mix添加試験ではTA1535，WP2 uvrA，TA1537で1500 μg/プレート以上で，他の2菌株で 5000 μg/プレートで抗菌性が認められた．

なお， TA100 および TA1535はS9 mixの添加にかかわりなく，変異コロニー数の増加が認められたため，TA100のS9 mix添加試験は3000 μg/プレート，その他は2500 μg/プレートを最高用量とし等差で用量を設定することとした．その他の3菌株の本試験における最高用量はS9 mix無添加試験，添加試験のいずれも2500 μg/プレート(TA98のS9 mix添加試験のみ5000 μg/プレート)とした．

〔本試験および再現性試験〕

本試験Ⅰの結果を Table 1-1，1-2 に示した．TA1535の S9 mix 添加試験で1000 μg/プレート以上の用量で溶媒対照値の2倍以上の変異コロニー数が認められた．TA100 のS9 mix添加試験では，変異コロニー数の増加が認められたものの，溶媒対照値の2倍に満たなかったため，さらに用量の間隔を狭めて本試験Ⅱを実施することとした．またTA1535 についてもTA100と同一の等差でS9 mix添加試験のみ最高用量を2000 μg/プレート，とすることとした．TA1537のS9 mix無添加試験では変異コロニー数の増加は認められなかった．なお，S9 mix無添加試験では TA1537を除く4菌株で，S9 mix添加試験ではTA100，TA1535を除く3種株で抗菌性を示さない用量が4用量に満なかったため，それぞれ最高用量を低くして本試験Ⅱおよび再現性試験を行うこととした．

本試験Ⅱの各検定菌の用量および結果を Table 2-1，2-2に示した．TA100のS9 mix無添加試験およびTA1535 のS9 mix無添加，添加の両試験で溶媒対照値の2倍以上の変異コロニー数が認められた．TA100のS9 mix添加試験では変異コロニー数の増加が認められたものの本試験Ⅰと同様，溶媒対照値の2倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．WP2 uvrA，TA98，TA1537はS9 mix無添加，添加のいずれの試験も用量依存性のある変異コロニー数の増加は認められなかった．

再現性試験は S9 mix無添加試験ではTA100，TA1535，WP2 uvrA，TA98について，S9 mix添加試験では，WP2 uvrA，TA98，TA1537について本試験Ⅱと同一用量で行った．その結果，TA1535は溶媒対照値の2倍以上となる用量依存性のある変異コロニー数の増加が認められたが，その他は溶媒対照値の2倍以上の変異コロニー数の増加は認められなかった(Table 3-1，3-2)．TA100については，変異コロニー数の増加は認められたものの溶媒対照値の2倍に満たなかったことから，さらに同一用量で再現性の確認を行い，変異コロニー数が溶媒対照値の2倍とならないことを確認した(Table 4)．

以上の結果に基づき， 3,4-ジクロロ-1-ブテンは，用いた試験系において変異原性を有するもの(陽性)と判定した．

文献

1）	D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2）	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp. 161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：坂本京子，川上久美子，原　　巧，
清水ゆり，松木容彦，中込まどか，
阿部昌弘，飯田さやか

（財）食品薬品安全センター秦野研究所

〒257 神奈川県秦野市落合729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya(Study Director)
Kyoko Sakamoto, Kumiko Kawakami, Takumi Hara,
Yuri Shimizu, Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi,
Masahiro Abe, and Sayaka Iida

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa 257 Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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