トリフェニルクロロメタンのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of Triphenylchloromethane in Rats

要約

トリフェニルクロロメタンを0(対照群)，12，60及び300 mg/kgの用量でCrj:CD(SD)IGS系雌雄ラットに28日間強制経口投与し，その毒性を検討した．対照群，60及び300 mg/kg群については，別に14日間の回復群を設けた．

雌雄いずれにも死亡は認められなかった．一般状態では，300 mg/kg群の雌雄で軟便がみられた．

体重では，60 mg/kg群の雌及び300 mg/kg群の雌雄で増加抑制が認められた．

摂餌量では，300 mg/kg群の雌雄で投与初期に一過性の摂餌量の減少が，投与期間後半に60及び300 mg/kg群の雄において摂餌量の増加がみられた．

血液学検査では，300 mg/kg群の雌雄でフィブリノーゲン量の増加，雄で血小板数の増加及びプロトロンビン時間並びに活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が認められた．

血液生化学検査では，300 mg/kg群の雌雄でGPT活性及び総コレステロールの増加とグルコースの減少が，雄で尿素窒素，総たん白質，リン脂質，総ビリルビン及びカルシウムの増加がみられた．60 mg/kg群では，雄で尿素窒素の増加，雌でグルコースの減少が認められた．

尿検査では60及び300 mg/kg群の雄でpHの低下が認められ，300 mg/kg群で摂水量の増加がみられた．

病理学検査では，肝臓，盲腸並びに腎臓に変化がみられた．肝臓では重量増加及び小葉中心性の肝細胞肥大が60及び300 mg/kg群の雌雄に，肉眼的に暗調化及び大型化が300 mg/kg群の雄にみられた．盲腸では，粘膜の肥厚が60 mg/kg群の雌と300 mg/kg群の雌雄にみられた．腎臓では，重量増加が300 mg/kg群の雌雄にみられた．

回復群では，上記の変化はいずれも消失あるいは軽減し，回復性が認められた．

以上の結果から，本試験条件下におけるトリフェニルクロロメタンの無影響量は，雌雄ともに12 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質及び被験液の調製

被験物質トリフェニルクロロメタン(黒金化成(株)，愛知，ロット番号1038，純度99.5 %)は融点115 ℃，沸点310 ℃の白色〜微黄色結晶性粉末である．なお，投与終了後の残余被験物質について分析を行った結果，使用期間中は安定であったことが確認された．

被験物質は，投与容量が10 mL/kg体重となるようオリーブ油に懸濁して1.2，6及び30 mg/mL懸濁液を調製した．調製は週1回以上の頻度で行い，使用時まで冷蔵(約4 ℃)保存した．なお，上記条件での被験液の安定性は確認済である．また，投与開始前及び投与終了週の2回，投与に使用する各濃度液について測定した結果，いずれも適正濃度かつ均一であった．

2.　使用動物及び飼育条件

4週齢のCrj:CD(SD)IGS系SPF雌雄ラットを日本チャールス・リバー(株)から購入し，15日間検疫・馴化飼育した後，体重増加が順調で一般状態に異常を認めなかった雌雄各42匹を選び，6週齡で試験に供した．投与開始日の体重範囲は，雄で192〜225 g(平均値:207.3 g)，雌で147〜173 g(平均値:159.0 g)であった．

動物は，群分け当日の体重に基づいて層別化し，各群の平均体重がほぼ均等となるよう，コンピュータを用いて各群に割り付けた．

動物は，温度23 ± 3 ℃，相対湿度50 ± 20 %，換気回数1時間当たり10〜15回，照明1日12時間の飼育室で，金属製網ケージに1匹ずつ収容し，固形飼料(放射線滅菌CRF-1，オリエンタル酵母工業(株))及び飲料水(水道水)を自由に摂取させ飼育した．

3.　投与量，群構成及び動物数

2週間投与による予備試験(投与量:30，100，300及び1000 mg/kg)の結果，1000 mg/kg群の雌雄で一過性の摂餌量減少，肝臓の暗調化並びに重量増加及び腎臓の重量増加，雄で体重増加抑制並びにGPT活性，BUN及び総コレステロールの増加がみられた．また，300 mg/kg群では雌雄で一過性の摂餌量減少及び肝臓並びに腎臓の重量増加，雄でGPT活性並びにBUNの増加及び肝臓の暗調化，100 mg/kg群では雌雄で肝臓の重量増加と雄で腎臓の重量増加がみられた．これらの結果から，本試験では12，60及び300 mg/kgの3用量を設定し，これに対照群を加えた計4群を使用した．さらに，対照群，60及び300 mg/kg群では回復群を設けた．動物数はいずれの群も雌雄各6匹とした．

被験液の投与容量は10 mL/kg体重とし，金属製胃ゾンデを用いて1日1回28日間強制経口投与した．対照群には溶媒(オリーブ油)を同様に投与した．投与液量は最新の体重を基準に算出した．回復期間は14日間とした．

4.　検査項目

1)　一般状態観察

投与期間中は毎日2回以上，回復期間中は毎日1回観察した．

2)　体重

投与期間及び回復期間を通じ，週2回(投与第1週と回復第1週は3回)の頻度で体重を測定した．

3)　摂餌量測定

投与期間及び回復期間を通じ，週2回(投与第1週は3回)の頻度で摂餌量を測定した．

4)　血液学検査

投与期間及び回復期間終了の翌日の剖検時に検査を行った．前日から一夜(約16時間)絶食させた動物をエーテル麻酔下で開腹し，腹大動脈から抗凝固剤(EDTA-2K)を加えた採血ビンに血液を採取し，赤血球数(電気抵抗変化検出法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，ヘマトクリット値(平均赤血球容積及び赤血球数から算出)，平均赤血球容積(電気抵抗変化検出法)，平均赤血球血色素量(ヘモグロビン量及び赤血球数から算出)，平均赤血球血色素濃度(ヘモグロビン量及びヘマトクリット値から算出)，血小板数(電気抵抗変化検出法)，白血球数(電気抵抗変化検出法)(以上コールター全自動8項目血球アナライザーT890，ベックマン・コールター(株))，網赤血球率(Brecher法)及び白血球百分率(May-Giemsa鏡検法)を測定した．また，3.8 %クエン酸ナトリウムを加えた容器に採取した血液を遠心分離(3000 rpm，10分間)し，得られた血漿を用いてプロトロンビン時間(クロット法)，活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)及びフィブリノーゲン量(トロンボプラスチン法)(以上，血液凝固自動測定装置，ACL 100，Instrumentation Laboratory)を測定した．

5)　血液生化学検査

血液学検査のための採血と同時に腹大動脈から採血し，遠心分離(3000 rpm，10分間)により得られた血清を用いてAlP(Bessey-Lowry法)，総コレステロール(CEH-COD-POD法)，トリグリセライド(GK-GPO-POD法)，リン脂質(PLD-ChOD-POD法)，総ビリルビン(アゾビリルビン法)，グルコース(Hexokinase-G6PD法)，尿素窒素(Urease-GLDH法)，クレアチニン(Jaffe'法)，ナトリウム，カリウム及び塩素(イオン選択電極法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(モリブデン酸法)，総たん白質(Biuret法)，アルブミン(BCG法)及びA/G比(総たん白質及びアルブミンから算出)を測定した．また，ヘパリンを加えた容器に採血し，遠心分離(3000 rpm，10分間)により得られた血漿を用いてGOT，GPT，LDH(UV-rate法)及びγ-GTP(γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド法)(以上いずれも全自動分析装置Monarch，Instrumentation Laboratory)を測定した．

6)　尿検査

投与第4週(検査当日の投与後)と回復第2週に動物を代謝ケージに個別に収容し，絶食・自由摂水下で4時間尿を，次いで自由摂食・自由摂水下でその後の20時間尿を採取した．採取した最初の4時間尿を用いてpH，たん白質，ケトン体，グルコース，潜血，ビリルビン，ウロビリノーゲン(以上URIFLET7A試験紙，アークレイ(株))，色調(肉眼観察)及び沈渣(鏡検)を検査した．また，その後に得られた20時間尿を用いて浸透圧(氷点降下法，全自動浸透圧測定装置 オートアンドスタット OM-6030，アークレイ(株))を測定し，4時間尿量及び20時間尿量から1日の尿量を算出した．更に，代謝ケージに収容した状態で，前日からの1日の摂水量を給水瓶を用いて測定した．

7)　剖検及び器官重量

上記血液学検査及び血液生化学検査のための採血後に放血致死させ，外表異常の有無を観察した後，頭部，胸部及び腹部を含む全身の器官・組織について肉眼的に異常の有無を観察した．続いて，脳，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，胸腺，心臓，肺(気管支を含む)，肝臓，脾臓，腎臓，副腎，精巣，精巣上体，卵巣及び子宮を摘出後，器官重量(絶対重量)を測定した．また，絶食後の体重及び絶対重量から体重100 g当たりの相対重量を算出した．

8)　病理組織学検査

全動物について以下に示す全器官・組織を採取し，リン酸緩衝10 %ホルマリン液(但し，眼球はリン酸緩衝液で調製した3 %グルタルアルデヒド・2.5 %ホルマリン液で，精巣はブアン液で固定した後リン酸緩衝10 %ホルマリン液で保存)で固定した後パラフィンに包埋した．投与期間終了時剖検動物では，このうち対照群と高用量群は包埋した全ての器官・組織について，また，中及び低用量群は被験物質投与による変化が疑われた肝臓及び盲腸についてそれぞれ切片とし，ヘマトキシリン・エオジン(H.E.)染色を施して鏡検した．回復群では，被験物質投与による変化が疑われた上記の肝臓及び盲腸について，まず対照群と高用量群の動物を検査した．その結果，被験物質による影響が疑われた雄の肝臓と雌の盲腸は，中用量群についても検索した．また，肉眼的異常部位については用量に関係なく鏡検した．

脳，脊髄，坐骨神経，眼球，心臓，気管，肺(気管支を含む)，胃，十二指腸，空腸，回腸，盲腸，結腸，直腸，肝臓，下垂体，甲状腺(上皮小体を含む)，副腎，胸腺，脾臓，腸間膜リンパ節，顎下リンパ節，腎臓，膀胱，精巣，精巣上体，前立腺，卵巣，子宮，骨及び骨髄(胸骨・大腿骨)，大腿部骨格筋，肉眼的異常部位

5.　統計解析

各検査項目のうち，数値化した成績についてまずBartlett法により各群の分散の均一性の検定を行った．その結果，分散が均一の場合には一元配置法による分散分析を行い，群間に有意差が認められたならば，Dunnett法を用いて対照群と各投与群との平均値の差の検定を行った．分散が均一でない場合には，Kruskal-Wallisの順位検定を行い，有意であればDunnett型の方法(Steel法)を用いて対照群と各投与群との平均順位の差の検定を行った．また，尿の定性的項目については累積χ2検定法を行った．検定はいずれも両側で，有意水準は5及び1 %とした．病理組織学検査の成績についてはMann-WhitenyのU検定を行った．検定は片側で，有意水準は5及び1 %とした．

結果

1.　一般状態

1)　投与期間

雌雄いずれの群にも死亡はみられず，12及び60 mg/kg群の雌雄では一般状態の異常も認められなかった．

300 mg/kg群では雄で投与3日以降，雌で投与5日以降，数例で軟便が連日観察された．なお，投与28日において軟便の例数が雌雄とも増加しているが，絶食により症状が増強された結果と考えられた．

2)　回復期間

回復期間を通じて，いずれの動物にも異常は認められなかった．

2.　体重(Fig. 1)

1)　投与期間

雄では，12及び60 mg/kg群の体重は対照群と同様に推移した．300 mg/kg群の体重は，投与21日以降対照群を有意に下回って推移し，投与期間中の体重増加量も対照群に比べ有意に低かった．

雌では，12 mg/kg群の体重は対照群と同様に推移した．60及び300 mg/kg群の体重は投与14日以降対照群をやや下回って推移し，投与14日の60 mg/kg群では有意差も認められた．また，これらの群における投与期間中の体重増加量は，対照群に比べ有意に低かった．

2)　回復期間

回復期間を通じて，雌雄の各投与群の体重は対照群と同様に推移した．

3.　摂餌量

1)　投与期間

雄では，12 mg/kg群の摂餌量は対照群と同様に推移した．60 mg/kg群では投与21日以降対照群に比べ有意な高値がみられた．300 mg/kg群では，投与4日に対照群に比べ有意な低値を示したが，投与14日以降は逆に対照群に比べ有意な高値を示した．

雌では，12及び60 mg/kg群の摂餌量は対照群と同様に推移した．300 mg/kg群では，投与4日に対照群に比べ有意な低値を示したが，その後は対照群と同様に推移した．

2)　回復期間

雄では，300 mg/kg群で対照群に比べて有意な高値が回復3日にみられたが，それ以降は対照群と同様に推移した．

雌では，回復期間を通じて各投与群の摂餌量は対照群と同様に推移した．

4.　血液学検査(Table 1)

1)　投与期間終了時検査

雄では，平均赤血球血色素濃度の有意な増加が全ての投与群にみられた．更に，300 mg/kg群では，血小板数及びフィブリノーゲン量の有意な増加並びにプロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間の有意な延長がみられた．なお，好酸球分画比率の有意な増加が60 mg/kg群にみられたが，用量に関連した変化ではなかった．

雌では，網赤血球率の有意な減少及びフィブリノーゲン量の有意な増加が300 mg/kg群にみられた．

2)　回復期間終了時検査

雌雄ともに，被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．なお，60 mg/kg群において網赤血球率の有意な減少が雄に，平均赤血球血色素量の有意な増加が雌にみられたが，いずれも用量に関連した変化ではなかった．

5.　血液生化学検査(Table 2)

1)　投与期間終了時検査

雄では，尿素窒素の有意な増加が60及び300 mg/kg群に，GPT活性，総たん白質，総コレステロール，リン脂質，総ビリルビン及びカルシウムの有意な増加とグルコースの有意な減少が300 mg/kg群にみられた．

雌では，グルコースの有意な減少が60及び300 mg/kg群に，GPT活性及び総コレステロールの有意な増加が300 mg/kg群にみられた．なお，60 mg/kg群においてAlP活性の有意な減少が雄に，ナトリウムの有意な増加が雌にみられたが，いずれも用量に関連した変化ではなかった．

2)　回復期間終了時検査

雄では，尿素窒素の有意な増加が60及び300 mg/kg群に，無機リンの有意な増加が300 mg/kg群にみられた．

雌では，被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．なお，60 mg/kg群でカルシウムの有意な増加がみられたが，用量に関連した変化ではな かった．

6.　尿検査(Table 3)

1)　投与第4週検査

雄では，pHの有意な低下が60及び300 mg/kg群に，摂水量の有意な増加が300 mg/kg群にみられた．なお，60 mg/kg群で尿たん白質，ケトン体及びウロビリノーゲンの有意な増加が，12及び60 mg/kg群で尿浸透圧の有意な高値が認められたが，いずれも用量に関連した変化ではなかった．

雌では，各投与群と対照群の間に差は認められなかった．

2)　回復第2週検査

雌雄ともに，被験物質投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．なお，ケトン体の有意な減少が60 mg/kg群の雄にみられたが，用量に関連した変化ではなかった．

7.　器官重量(Table 4)

1)　投与期間終了時剖検例

雄では，60 mg/kg群で肝臓の相対重量，300 mg/kg群で肝臓及び腎臓の相対重量の有意な増加がみられた．

雌では，60 mg/kg群で肝臓の相対重量の有意な増加，300 mg/kg群で肝臓の絶対及び相対重量並びに腎臓の相対重量の有意な増加がみられた．

他に，300 mg/kg群の脳，肺及び副腎において，相対重量の有意な増加がみられたが，いずれも剖検時の体重の低値に起因する変化と考えられた．また，副腎の相対重量の有意な増加が60 mg/kg群の雌にみられたが，用量に関連した変化ではなかった．

2)　回復期間終了時剖検例

雄では，対照群と各投与群との間に差は認められなかった．

雌では，300 mg/kg群において肝臓の相対重量の有意な増加がみられた．

他に，60 mg/kg群の雄の甲状腺において相対重量の有意な減少がみられたが，用量に関連した変化ではなかった．

8.　剖検所見

1)　投与期間終了時剖検例

雄では，300 mg/kg群で肝臓の暗調化が3例，大型化が1例にみられた．

雌では，いずれの動物にも異常は認められなかった．

2)　回復期間終了時剖検例

雌雄ともに，いずれの動物にも異常は認められなかった．

9.　病理組織学検査(Table 5)

1)　投与期間終了時剖検例

被験物質投与に関連すると考えられる変化が，雌雄の肝臓及び盲腸にみられた．

肝臓:軽微あるいは軽度の小葉中心性肝細胞肥大が60 mg/kg群の雄3例と雌5例及び300 mg/kg群の雌雄全例にみられた．なお，軽微な微小肉芽腫が対照群の雌1例にみられたが，その出現状況から偶発所見と判断した．

盲腸:軽微な粘膜の肥厚が60 mg/kg群の雌2例及び300 mg/kg群の雌雄各5例にみられた．

上記以外の所見は，生理的変化である脾臓の髄外造血を除きその出現状況及び病理学的性状から偶発所見と判断した．

2)　回復期間終了時剖検例

被験物質投与に関連すると考えられる変化が，雄の肝臓及び雌の盲腸にみられた．

肝臓:軽微な小葉中心性肝細胞肥大が300 mg/kg群の雄1例にみられた．なお，軽微な微小肉芽腫が対照群の雌雄各3例と300 mg/kg群の雌2例にみられたが，その出現状況から偶発所見と判断した．

盲腸:軽微な粘膜の肥厚が300 mg/kg群の雌2例にみられた．

考察

投与期間中を通じて死亡動物はみられなかった．一般状態では，投与3〜5日以降300 mg/kg群の雌雄で軟便が認められた．

体重では，60 mg/kg群の雌と300 mg/kg群の雌雄で体重増加抑制が認められた．

摂餌量では，投与開始後一過性の摂餌量減少が300 mg/kg群の雌雄にみられた．しかし，投与期間の後半では，逆に摂餌量の増加が60及び300 mg/kg群の雄に認められた．300 mg/kg群の雄では体重増加抑制も認められていることから，被験物質投与による摂餌効率の低下が示唆された．

尿検査では，pHの低下が60及び300 mg/kg群の雄に，摂水量の増加が300 mg/kg群の雄にみられた．摂水量については，300 mg/kg群で軟便がみられていることから，糞中に過剰に排泄された水分を補うための増加と考えられた．

血液学検査では，300 mg/kg群の雌雄でフィブリノーゲン量の増加，雄で血小板の増加及びプロトロンビン時間並びに活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が認められた．なお，雄において平均赤血球血色素濃度の増加がすべての投与群にみられたが，その変化の程度が用量に関連していないこと，他の赤血球項目に何ら変化がみられていないことから毒性ではないと判断した．また，300 mg/kg群の雌にみられた網赤血球率の減少も他の赤血球項目に変化がないことから毒性学的意義のない変化と考えられた．

血液化学検査では，GPT活性の増加が300 mg/kg群の雌雄にみられ，被験物質による肝機能障害が示唆された．また，同用量群の雌雄で総コレステロールの増加，雄で総ビリルビン，リン脂質及び総たん白質の増加がみられたが，これらも被験物質による肝臓への影響と推定された．更に，尿素窒素の増加が60及び300 mg/kg群の雄にみられ，被験物質の腎臓への影響も示唆された．なお，60 mg/kg群の雌と300 mg/kg群の雌雄でグルコースの減少がみられたが，前述の摂餌効率の低下を反映した変化と推察された．他にカルシウムの増加が300 mg/kg群の雄にみられたが，機序は不明であった．

病理組織学検査では，肝臓，腎臓及び盲腸に変化がみられた．腎臓では，重量増加が300 mg/kg群の雌雄にみられ，血液化学検査の所見と同様，被験物質の腎臓に対する影響が示唆された．肝臓では，肉眼的に大型化及び暗調化が300 mg/kg群の雄に，重量増加及び組織学検査における小葉中心性の肝細胞肥大が60及び300 mg/kg群の雌雄に認められた．盲腸では，粘膜の肥厚が60 mg/kg群の雌及び300 mg/kg群の雌雄に認められた．

休薬により，上記の変化はいずれも消失あるいは軽減し，回復性が認められた．なお，無機リンの増加が300 mg/kg群の雄にみられたが，回復期間のみの変化であり，原因となる腎障害などの変化も認められないことから毒性学的意義はないと判断した．

以上の如く，トリフェニルクロロメタンをラットに28日間反復経口投与した結果，主な変化として60 mg/kg群では，肝重量増加並びに小葉中心性肝細胞肥大が雌雄に，尿素窒素の増加が雄に，体重増加抑制，グルコースの減少並びに盲腸粘膜の肥厚が雌にみられた．300 mg/kg群ではこれらの変化に加え，軟便及びフィブリノーゲン量，GPT活性，総コレステロール並びに腎臓重量の増加が雌雄に，プロトロンビン時間並びに活性化部分トロンボプラスチン時間の延長，リン脂質，総たん白質並びに総ビリルビンの増加が雄にみられた．一方，12 mg/kg群の雌雄では変化は認められなかった．

これらの結果から，本試験におけるトリフェニルクロロメタンの無影響量は雌雄ともに12mg/kg/dayと推定された．

連絡先
試験責任者：榎並倫宣
試験担当者：鷹野正生，畠山和久，永谷真理子，津田敏治，勝亦倶慶
(株)ボゾリサーチセンター　御殿場研究所
〒412-0039　静岡県御殿場市かまど1284
Tel 0550-82-2000Fax 0550-82-2379

Correspondence
Authors:Tomonori Enami (Study director)
Masao Takano, Kazuhisa Hatayama, Kazutoshi Tamura, Toshiharu Tsuda, Toyohisa Katsumata
Gotemba Laboratory, Bozo Research Center Inc.
1284, Kamado, Gotemba-shi, Shizuoka, 412-0039, Japan
Tel +81-550-82-2000Fax +81-550-82-2379