テトラメチルアンモニウムヒドロキシドの細菌を用いる復帰変異試験
Reverse Mutation Test of Tetramethylammonium hydroxide on Bacteria
要約
テトラメチルアンモニウムヒドロキシドについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．
検定菌として，Salmonella typhimurium(TA100, TA98, TA1535, TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．試験は2回繰り返して実施し，S9 mix無添加群の各試験菌株およびS9 mix添加群のWP2 uvrAを除いた試験菌株について39.1〜1250 μg/plate，S9 mix添加群のWP2 uvrAについて156〜5000 μg/plateのそれぞれ6用量で実施した．
その結果，S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．
以上の結果より，本試験条件下ではテトラメチルアンモニウムヒドロキシドは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．
方法
1. 試験菌株
細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA1537 1)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA 2)の5種類の菌株を選択した．
ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成11年3月31日ならびに平成11年6月29日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．
各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80 ℃で保存した．
2. 培地の調製
1) 最少グルコース寒天平板培地(プレート)
オリエンタル酵母工業(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5 %の寒天(OXOID:No. 1)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．
2) トップアガー(軟寒天)
塩化ナトリウム0.5 %を含む0.6 % Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプトファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．
3. 前培養条件
内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 %ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37 ℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．
4. S9 mix
製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
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| 成 分 | S9 mix 1 mL中の量 |
| S9 | 0.1 mL |
| MgCl2 | 8 μmol |
| KCl | 33 μmol |
| G-6-P | 5 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| Na-リン酸緩衝液(pH 7. 4) | 100 μmol |
| 精製水 | 残 量 |
5. 被験物質
テトラメチルアンモニウムヒドロキシド(ロット番号:81021A)は純度20.0 %の水溶液であり，水溶液中で安定である．昭和電工(株)(東京)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで室温で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．
6. 被験物質液の調製
試験の都度，被験物質を日本薬局方注射用水((株)大塚製薬工場)を用いて希釈して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．ただし，原液中での被験物質濃度が20.0 %であることを考慮して調製した．
7. 試験用量の設定
19.5，78.1，313および1250 μg/plateの用量を用いて予備的な試験を実施した．S9 mix無添加群の各試験菌株ならびにS9 mix添加群のWP2 uvrAを除いた試験菌株では，1250 μg/plateにおいて試験菌株に対する生育阻害作用が観察された．
従って，本試験においてはS9 mix無添加群の各試験菌株ならびにS9 mix添加群のTA100，TA1535，TA98ならびにTA1537で1250 μg/plate，S9 mix添加群のWP uvrAで5000 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．
8. 陽性対照物質
陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20 ℃)した．
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2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(AF-2:和光純薬工業(株))
アジ化ナトリウム(NaN3:和光純薬工業(株))
9-アミノアクリジン塩酸塩(9-AA:Aldrich社)
2-アミノアントラセン(2-AA:和光純薬工業(株))
9. 試験方法
Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/Lナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加した．さらに，試験菌液100 μLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37 ℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(×60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．また，独立して試験を2回実施した．
10. 結果の解析
復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．
なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．
結果および考察
1回目の試験結果をTable 1〜2に，2回目の試験結果をTable 3〜4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群のすべての試験菌株の高用量群において，テトラメチルアンモニウムヒドロキシド処理による生育阻害作用が観察された．しかしながら，復帰突然変異コロニー数については，S9 mix無添加群，S9 mix添加群とも溶媒対照と同等の値であり，明確な増加傾向は認められなかった．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，コロニー計数時，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．以上の試験結果から，本試験条件下において，テトラメチルアンモニウムヒドロキシドの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．
なお，本被験物質の類縁体であるtetramethylammonium bromide，tetramethylammonium chloride，tetramethylammonium iodide，tetramethylammonium fluoride tetrahydrate，tetramethylammonium hexafluorophosphate，tetramethylammonium hydroxide pentahydrateおよびtetramethylammonium tetrafluoroborateの変異原性に関する報告はなかった．
文献
| 1) | D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983). |
| 2) | M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3(1976). |
| 連絡先 |
| 試験責任者： | 中嶋 圓 |
| 試験担当者： | 菊池正憲，益森勝志 |
| (財)食品農医薬品安全性評価センター |
| 〒437-1213 静岡県磐田郡福田町塩新田582-2 |
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | |
| Correspondence |
| Authors: | Madoka Nakajima(Study Director)
Masanori Kikuchi, Shoji Masumori |
| Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center) |
| 582-2 Shioshinden , Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan |
| Tel +81-538-58-1266 | Fax +81-538-58-1393 | |