検定菌としてSalmonella typhimurium TA100、TA1535、 TA98、TA1537およびEscherichia coliWP2 uvrAを用い、直接試験および代謝活性化試験のいずれも、用量設定試験は50〜5000 μg/プレートの用量で、本試験は 312.5〜5000 μg/プレートの用量で試験を行った。
その結果、2回の本試験とも、用いた5種類の検定菌において、いずれの用量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから、4−メチルベンゼンスルホンアミドは、用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された。
この試験は、サルモネラ（ネズミチフス菌）におけるヒスチジン要求性から非要求性への復帰変異1）、ならびに大腸菌におけるトリプトファン要求性から非要求性への復帰変異2）を指標とした変異原の検出系である。
試験は、被験物質をそのまま検定菌に作用させる直接試験と、哺乳動物のもつ薬物代謝酵素（S9混液）によって産生される被験物質の代謝物の変異原性を試験する代謝活性化試験とからなっている。
本試験は、「新規化学物質に係る試験の方法について」（昭和62年3月31日、環保業第237号、薬発第306号、62基局第303号）およびOECD化学品試験法ガイドライン：471, 472に準拠し、化学物質GLP（昭和59年3月31日、環保業第39号、薬発第229号、59基局第85号、改訂昭和63年11月18日、環企研第233号、衛生第38号、63基局第823号）に基づいて実施した。
Salmonella typhimurium TA100、Salmonella typhimurium TA1535、Salmonella typhimurium TA98、Salmonella typhimurium TA1537の４菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国、カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた。
Escherichia coli WP2uvrA株は1979年5月9日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた。
検定菌は、−80℃以下で凍結保存した。試験に際して、0.5%塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス（Difco）を入れたＬ字型試験管に種菌を接種し、37℃、10時間往復振とう培養したものを検定菌液とした。
4−メチルベンゼンスルホンアミドは、ジメチルスルホキシド（ロット番号：DSL5887、和光純薬工業、以下DMSOと略）を用いて50 mg/mlになるように調製した後、同溶媒でさらに公比2ないし3で希釈したものを、速やかに試験に用いた。
試験の開始に先立って、秦野研究所において4−メチルベンゼンスルホンアミドのDMSO溶液中での安定性試験を行った。安定性試験における溶媒は当研究所で実施される、培養細胞を用いる染色体異常試験と共通なことから、両試験における最高濃度（340 mg/ml）および最低濃度（3.125 mg/ml）の2濃度について室温遮光条件下で実施した。その結果、調製後3時間における各3サンプルの平均含量は、それぞれ初期値の平均（0時間）に対して98.8%および98.4%であった。これらの値は、当研究所の標準操作手順書の基準（初回の測定平均値の90%以上）を満たしていた。
また、本試験に用いた調製検体について、含量測定試験を行った結果、50 mg/ml溶液の含量は、既定濃度に対し100〜101%、3.125 mg/ml溶液は、103〜104%であった。これらの値も当研究所の標準操作手順書の基準（平均含量は添加量の85%以上）を満たしていた。
以上の結果から、4−メチルベンゼンスルホンアミドはDMSO溶液中では安定であり、また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された。
| AF-2 | ： | フリルフラマイド | （上野製薬 (株)） |
| SA | ： | アジ化ナトリウム | （和光純薬工業 (株)） |
| 9-AA | ： | 9-アミノアクリジン | （東京化成工業 (株)） |
| 2-AA | ： | 2-アミノアントラセン | （和光純薬工業 (株)） |
| (A) | バクト・アガー（Difco） | 0.6% |
| 塩化ナトリウム | 0.5% | |
| (B) | * L−ヒスチジン | 0.5 mM |
| ビオチン | 0.5 mM |
| *： | WP2用には、0.5 mM L−トリプトファン水溶液を用いた。 |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2g |
| クエン酸・1水和物 | 2g |
| リン酸水素二カリウム | 10g |
| リン酸水素アンモニウムナトリウム・4水和物 | 3.5g |
| グルコース | 20g |
| バクト・アガー（Difco） | 15g |
| S9** | 0.1 ml |
| 塩化マグネシウム | 8 μmol |
| 塩化カリウム | 33 μmol |
| グルコース・6リン酸 | 5 μmol |
| NADH | 4 μmol |
| NADPH | 4 μmol |
| 0.2Mリン酸緩衝液（pH 7.4） | 0.5 ml |
| **： | 7週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール（PB）、および5, 6-ベンゾフラボン（BF）の併用投与で酵素誘導して作製したS9（キッコーマン（株））を用いた。 |
小試験管中にトップアガー2ml、被験物質調製液0.1ml、リン酸緩衝液0.5 ml（代謝活性化試験においてはS9混液0.5 ml）、検定菌液0.1 mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた。また、対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO、または数種の陽性対照物質溶液を用いた。各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量は表
中に示した。培養は37℃で48時間行い、生じた復帰変異コロニー数を算定し、それぞれその平均値と標準偏差を求めた。
以上の結果に基づき、4−メチルベンゼンスルホンアミドは、用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した。
| 1) | D. M. Maron and B. N. Ames, Mutation Research., 113, 173 (1983). |
| 2) | M. H. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," (B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols and C. Ramel eds.) , Elsevier Science Publisher, New York, 1984, p161. |
| 連絡先： | |||
| 試験責任者 | 高鳥浩介 | ||
| （財）食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
| 〒257 神奈川県秦野市落合 729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence: | |||
| Takatori, Kousuke | |||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | |||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan | |||
| Tel 81-463-82-4751 | Fax 81-463-82-9627 | ||
