1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサンの
細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 1,1-Bis(tert-butyldioxy)-3,3,5-trimethlcyclohexane on Bacteria

要約

1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサンの遺伝子突然変異誘発性の有無を検討するため，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験は，指標菌株としてSalmonella typhimurium TA100，TA1535，TA98，TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，S9 mix非存在(直接法)および存在(代謝活性化法)下でプレインキュベーション法により行った．

用量は，用量設定試験の結果，5000 μg/plateまでの用量で直接法および代謝活性化法ともに全ての菌株において生育阻害が認められなかったため，313〜5000 μg/plateの範囲(公比2)で設定した．

試験を2回行った結果，代謝活性化の有無にかかわらず，全ての菌株において復帰変異コロニー数の増加は認められず，また，菌の生育阻害も認められなかった．

以上の成績から，1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサンの細菌に対する遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．

方法

1.　指標菌株

国立公衆衛生院地域環境衛生学部から1994年12月19日に分与を受けたS. typhimurium TA98，TA100，TA1535，TA1537 1)およびE. coli WP2 uvrA 2)の5菌株を用いた．各菌株は，超低温槽で-80 ℃以下に凍結保存した．

試験に際して，各凍結菌株を解凍後，その25 μLをニュートリエントブロス(Bacto nutrient broth dehydrated, Difco Laboratories)液体培地15 mLに接種し，37 ℃で12時間振盪培養した．培養後の懸濁菌液は濁度を測定し，濁度と生菌数の換算式より1 mLあたり1 × 109以上の生菌数が得られていることを確認し，試験菌液とした．

各菌株の遺伝的特性検査は，凍結保存菌の調製時並びに各実験ごとに行い，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

2.　被験物質

1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサン(ロット番号8X01，日本油脂(株)(東京)提供)は，無色ないし淡黄色透明の液体で，水およびジメチルスルホキシド(DMSO)に不溶，アセトンに易溶であり，純度97.9 %(不純物として，原料である3,3,5-トリメチルシクロヘキサン約1.89 %を含む)の物質である．被験物質は，冷暗所(4 ℃)で密栓保管した．

実験終了後，残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

3.　被験物質供試液の調製

溶媒にアセトン(和光純薬工業(株))を用い，被験物質を溶解して最高用量の供試液(原液)を調製した．この原液の一部を溶媒で順次希釈して所定用量の供試液を調製した．供試液は，用時調製した．

4.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記のものを使用した．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株))
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9-AA:9-アミノアクリジン(Aldrich Chemical Co.)

AF-2および2-AAはDMSO(和光純薬工業(株))に，NaN3および9-AAは蒸留水((株)大塚製薬工場)に溶解した．

5.　培地

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

テスメディアAN培地(オリエンタル酵母工業(株))を購入し，使用した．培地1 Lあたりの組成は下記のとおりであり，径90 mmのシャーレ1枚あたりに30 mLを分注したものである．
硫酸マグネシウム・七水塩0.2 g
クエン酸・一水塩2 g
リン酸水素二カリウム10 g
リン酸一アンモニウム1.92 g
水酸化ナトリウム0.66 g
グルコース20 g
寒天(OXOID Agar No.1)15 g

2)　アミノ酸添加軟寒天培地(トップアガー)

0.6 w/v%寒天粉末(Difco Laboratories)および0.5 w/v%塩化ナトリウムの組成の軟寒天を調製し，これに，S. typhimurium用には0.5 mM D-ビオチンおよび0.5 mM L-ヒスチジン水溶液，E coli用には0.5 mM L-トリプトファン水溶液を1/10容加え，トップアガーとした．

6.　S9 mix

エームステスト用凍結S9 mix(キッコーマン(株))を購入し，製造後6ヶ月以内に使用した．S9は，誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与した prague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．

7.　試験方法

試験は，プレインキュベーション法で行った．

試験管に使用溶媒0.05 mL，被験物質供試液0.05 mLあるいは陽性対照物質溶液0.1 mLを入れ，次いで直接法では0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)を0.5 mL，代謝活性化法ではS9 mixを0.5 mL加え，続いて試験菌液0.1 mLを分注し，37 ℃で20分間振盪培養した．培養終了後，45 ℃に保温したトップアガー2 mLを加えた混合液をプレート上に重層した．37 ℃で48時間培養後，復帰変異コロニーを計数し，同時に指標菌株の生育阻害の有無を実体顕微鏡を用いて観察した．プレートは，用量設定試験では各用量とも1枚，本試験では3枚を使用した．本試験は，同一用量を用いて2回行った．

8.　結果の判定

被験物質処理プレートにおける復帰変異コロニー数(平均値)が溶媒対照値の2倍以上を示し，用量依存性および結果の再現性が認められる場合を陽性とした．

但し，明確な用量依存性が認められない場合においても，陽性値を示す試験結果に再現性が認められれば陽性と判定することとした．

結果および考察

20〜5000 μg/plateの範囲で行った用量設定試験においては，代謝活性化の有無にかかわらず，いずれの菌株においても菌の生育阻害は認められなかった．したがって，本試験における被験物質の用量は，最高用量を5000 μg/plateとし，以下公比2で，2500，1250，625および313 μg/plateとした． 試験を2回行った結果(Tables 1〜4)，直接法および代謝活性化法のいずれの場合も，供試した全ての菌株において復帰変異コロニー数は，溶媒対照値の2倍を越えることはなく，また，菌の生育阻害も認められなかった．

なお，代謝活性化の有無にかかわらず，1250 μg/plate 以上の用量で培養終了時，プレート上に被験物質と思われる油滴様物が認められた．

以上の成績から，本実験条件下では，1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサンの遺伝子突然変異誘発性は陰性と判定した．

なお，1,1-ビス(tert-ブチルジオキシ)-3,3,5-トリメチルシクロヘキサンおよびその類縁化合物の変異原性に関する報告は見当たらない．

文献

1)D. M. Maron, B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173(1983).
2)M. H. L. Green, “Handbook of Mutagenicity Test Procedures,” 1, Vol.3, eds. by B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, C. Ramel, Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1984, pp.161-187.

連絡先
試験責任者：野田　篤
試験担当者：野田　篤，昆　尚美
(財)畜産生物科学安全研究所
〒229-1132　神奈川県相模原市橋本台3-7-11
Tel 042-762-2775Fax 042-762-7979

Correspondence
Authors:Atsushi Noda(Study director)
Naomi Kon
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, kanagawa, 229-1132 Japan
Tel +81-42-762-2775Fax +81-42-762-7979