フマル酸ジエチルの細菌を用いる復帰突然変異試験

Reverse Mutation Test of Diethyl fumarate on Bacteria

要約

OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，フマル酸ジエチルについて，細菌を用いる復帰突然変異試験をプレート法により実施した．

検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，用量設定試験は直接法および代謝活性化法のいずれも，50～5000μg/プレートの用量で，本試験は用量設定試験で抗菌性が認められたことから，本試験の直接法では，TA100は9.375～300μg/プレート，TA1535, TA98およびTA1537は78.13～2500μg/プレート，さらにWP2 uvrAでは156.3～5000μg/プレートの用量で，また代謝活性化法ではすべての検定菌で312.5～5000μg/プレートの用量で試験を実施した．

その結果，２回の本試験とも，用いた５種類の検定菌について，いずれの用量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから，フマル酸ジエチルは，用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された．

方法

〔検定菌〕

Salmonella typhimurium TA100

Salmonella typhimurium TA1535

Escherichia coli WP2 uvrA

Salmonella typhimurium TA98

Salmonella typhimurium TA1537

S. typhimuriumの４菌株は1975年10月31日にアメリカ合衆国，カリフォルニア大学のB. N. Ames博士から分与を受けた．

E. coli WP2 uvrA株は1979年５月９日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた．検定菌は，-80℃以下で凍結保存した．

試験に際して，ニュートリエントブロスNo.２（Oxoid）を入れたＬ字型試験管に種菌を接種し，37℃，約11時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．

〔被験物質〕

フマル酸ジエチル（CAS No. 623-91-6）は，分子量172.20の無色透明，比重1.055（20℃/20℃）の液体である．純度93.3％のもの（不純物としてマレイン酸ジエチル4.9％，その他1.8％を含む，ロット番号：0158，黒金化成（株）製造）を（社）日本化学工業協会から供与された．被験物質は，使用時まで密栓して冷所に保管した．

フマル酸ジエチルは，アセトン（ロット番号：DSR3251，和光純薬工業（株））を用いて50mg/mlとなるように調製した後，同溶媒で更に公比２ないし３で希釈したものを，速やかに試験に用いた．なお，調製にあたって，純度および比重換算は行わなかった．

試験の開始に先立って，秦野研究所においてフマル酸ジエチルのアセトン溶液中での安定性試験を行った．本試験における最高濃度（50mg/ml）および最低濃度（90μg/ml）の２濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後４時間における各３サンプルの平均含量は，それぞれ初期値（０時間）の平均に対して，108および99.1％であった．

また，本試験に用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，50mg/ml溶液の含量は既定濃度に対し，101～109％，93.75μg/ml溶液は，108～109％であった．

以上の結果から，フマル酸ジエチルはアセトン溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．

〔陽性対照物質〕

用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである．

AF-2	：	フリルフラマイド	（上野製薬（株））
SA	：	アジ化ナトリウム	（和光純薬工業（株））
9-AA	：	9-アミノアクリジン	（SigmaChem.Co.）
2-AA	：	2-アミノアントラセン	（和光純薬工業（株））

AF-2,2-AAはDMSO（和光純薬工業（株））に溶解したものを-20℃で凍結保存し，用時解凍した．9-AAはDMSOに，SAは蒸留水に溶解し速やかに試験に用いた．

〔培地およびS9混液の組成〕

1)トップアガー（TA菌株用）

下記の水溶液（A）および（B）を容量比10:1の割合で混合した．

（A）	バクトアガー（Difco）	0.6％
	塩化ナトリウム	0.5％
（B）*	L-ヒスチジン	0.5mＭ
	ビオチン	0.5mＭ

*：WP2用には，0.5mM L-トリプトファン水溶液を用いた．

2)合成培地

培地は，日清製粉（株）製の最少寒天培地を用いた．なお，培地１lあたりの組成は下記のとおりである．

硫酸マグネシウム・7水和物	0.2g
クエン酸・1水和物	2g
リン酸水素二カリウム	10g
リン酸水素アンモニウムナトリウム・4水和物	3.5g
グルコース	20g
バクトアガー（Difco）	15g

径90mmのシャーレ１枚あたり30mlを流して固めてある．

3)S9混液（１ml中下記の成分を含む）

S9**	0.1ml
NADH	4μmol
塩化マグネシウム	8μmol
NADPH	4μmol
塩化カリウム	33μmol
0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4）	0.5ml
グルコース・6リン酸	5μmol

**：	７週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール（PB）および5,6-ベンゾフラボン（BF）の併用投与で酵素誘導して作製したS9（キッコーマン（株））を用いた．

〔試験方法〕

プレート法を用いて，直接法および代謝活性化法によって試験を行った．

小試験管中にトップアガー２ml，被験物質調製液0.1ml，リン酸緩衝液0.5ml（代謝活性化試験においてはS9混液0.5ml），検定菌液0.1mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにアセトン，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTableに示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定し，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面上の菌膜の状態から判断した．

〔判定基準〕

用いた５種の検定菌のうち，１種以上の検定菌の直接法あるいは代謝活性化法において，被験物質を含有する平板上における復帰変異コロニー数が，陰性対照のそれに比べて２倍以上に増加し，かつ，その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に，当該被験物質は本試験系において変異原性を有する（陽性）と判定することとした．

結果および考察

〔用量設定試験〕

フマル酸ジエチルについて，50～5000μg/プレートの範囲で，公比約３とし，試験を実施したところ，すべての検定菌の直接法および代謝活性化法において，高用量で抗菌性が認められた．抗菌性はTA100の直接法において最も強く認められ，500μg/プレートの用量でも認められた．その他の検定菌においては，TA1535とTA98の直接法およびTA100の代謝活性化法では1500μg/プレートの用量まで，それ以外は5000μg/プレートの用量で抗菌性が認められた．抗菌性について，追加試験を行ったところ，TA100の直接法においては，625μg/プレートの用量まで抗菌性が認められたが，WP2 uvrAの直接法では2500μg/プレート，TA100の代謝活性化法では5000μg/プレートの用量でも抗菌性は認められなかった．

以上の結果から，本試験における最高用量を直接法においては，TA100では300μg/プレート，TA1535，TA98およびTA1537については2500μg/プレート，さらにWP2 uvrAについては5000μg/プレートとし，公比２で６用量を，代謝活性化法においてはすべての検定菌で5000μg/プレートとし，公比２で５用量を設定することとした．

〔本試験〕

結果をTables 1, 2に示した．フマル酸ジエチルについて上記の用量範囲で試験を実施した．２回の試験を通して，用いた５種類の検定菌の直接法，代謝活性化法のいずれにおいても，陰性対照の２倍以上となる変異コロニー数の増加は認められなかった．TA1535およびWP2 uvrAの代謝活性化法以外の試験においては，最高用量において，抗菌性が認められた．

以上の結果に基づき，フマル酸ジエチルは，用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した．

文献

1）	D. M. Maron, and B. N. Ames, Mutation Research. 113, 173-215（1983）.
2）	M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," （B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, and C. Ramel eds.） Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. 1984, pp.161-187.

連絡先

試験責任者：澁谷　徹

試験担当者：坂本京子，加藤基恵，石原尚古，川上久美子，
松木容彦，中込まどか，北嶋美似子

（財）食品薬品安全センター秦野研究所

〒257 神奈川県秦野市落合729-5

Tel 0463-82-4751 Fax 0463-82-9627

Correspondence

Authors: Tohru Shibuya (Study director)
Kyoko Sakamoto, Motoe Katoh,Naoko Ishihara, Kumiko Kawakami,
Yasuhiko Matsuki, Madoka Nakagomi, Miiko Kitashima

Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center

729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan

Tel +81-463-82-4751 Fax +81-463-82-9627

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