3-エチルフェノールのラットを用いる28日間反復経口投与毒性試験

Twenty-eight-day Repeat Dose Oral Toxicity Test of 3-Ethylphenol in Rats

要約

オリブ油に溶解した3-エチルフェノールの0，100，300および1000 mg/kgを，1群あたり雌雄各7あるいは14匹のCrj:CD(SD)IGS系ラットに28日間反復経口投与してその毒性と，また0および1000 mg/kg投与終了後の14日間の回復性も併せて検討した．その結果，以下の成績を得た．

100および300 mg/kg投与群では，各検査において変化は認められなかった．

1000 mg/kg投与群において，一般状態では，雌雄とも投与期間中に横臥あるいは腹臥，よろめき歩行および外尿道口周囲の被毛の汚れが散見され，雌で1例に振戦も認められた．体重および摂餌量では，雄で投与2および7日に低値が認められた．尿検査では，投与4週に雌雄とも飲水量および尿量の増加が認められた．血液生化学検査では，雌雄ともにGPTの増加および雌に総コレステロールの増加が認められた．器官重量では雌雄の肝臓に絶対重量あるいは相対重量の高値が，また雄で腎臓の相対重量の高値が認められた．剖検では，雌雄ともに前胃の境界縁の肥厚がみられ，病理組織学検査では前胃の境界縁およびその他の部位に扁平上皮の過形成が認められた．この変化は3-エチルフェノールの刺激性に起因すると考えられた．

これらの変化はいずれも回復期間終了時には認められず可逆性の変化であった．

以上のことから，本試験条件下における3-エチルフェノールの無影響量(NOEL)は雌雄とも300 mg/kg/dayと考えられた．

方法

1.　被験物質および投与液の調製

3-エチルフェノール(純度:96.2 %，Lot No. 81102，田岡化学工業(株)，大阪)は，不純物としてp-エチルフェノールを1.8 %，フェノールを0.8 %含有する無色ないし明黄色の液体である．入手後の被験物質は遮光気密容器に入れ，4〜10℃の冷暗所で保存し，残余被験物質を製造業者が分析し，投与期間中の被験物質の安定性を確認した．媒体はオリブ油(ヤクハン製薬(株)を用い，これに被験物質を所定の濃度となるように溶解させた．調製液は，室温3時間，遮光・冷蔵保存条件下で8日間安定であることから，調製後直ちに遮光気密容器に入れて冷蔵保存した．また，これらの調製液について濃度を確認し，設定値の±10 %以内にあることを確認した．

2.　試験動物および飼育条件

日本チャールス・リバー(株)より受け入れた4週齢のSprague-Dawley系雌雄ラット(Crj:CD(SD)IGS)を6または7日間の検疫・馴化を行った後，雌雄各42匹を選択して5週齢で試験に供した．投与開始日の体重は雄が144〜166 g，雌が127〜145 gであった．動物は，温度21〜23℃，湿度37〜64 %，換気回数10〜15回/時間および照明時間12時間(8時から20時まで点灯)に制御されたバリアシステムの飼育室で，ブラケット式金属製金網床ケージに群分け前は1ケージあたり4または5匹を収容し，群分け後は個別飼育した．飼料は，g線照射固型飼料(CRF-1，オリエンタル酵母工業(株)を金属製給餌器を用いて，飲料水は札幌市水道水を自動給水装置を用いてそれぞれ自由に摂取させた．

3.　投与量および投与方法

投与量設定試験では，雌雄のラットに0(オリブ油)，250，500および1000 mg/kgの4用量を1群5匹に投与した．1000 mg/kg投与群では，雌で初回投与後によろめき歩行に続いて横臥がみられ，投与2日に体重減少および摂餌量の低値が認められた．雄では一般状態に異常はみられなかったが，体重増加抑制がみられ，摂餌量にも低値または低値傾向がみられた．また，雌雄ともGPTおよび肝臓の絶対重量と相対重量に高値または高値傾向がみられ，雌では総コレステロールの高値もみられた．500 mg/kg投与群では，雄でGPTが高値を示し，雌で肝臓の絶対重量および相対重量が高値または高値傾向を示した．250 mg/kg投与群でも，雄でGPTが高値傾向を示したが，雌では変化は認められなかった．

以上の結果から，雌雄のラットに明らかな毒性の発現が予測される用量として最高用量に1000 mg/kgを設定し，公比約3で除して，300および100 mg/kg，これに溶媒を投与する対照群を設けた．1群の動物数は雌雄とも7匹とし，対照群および1000 mg/kg投与群には，さらに14日間の回復群として2群を割り付け，投与前々日の体重に基づいて層化無作為抽出法により群分けを行った．

各個体の投与液量は投与日に最も近い測定日の体重に基づいて5 mL/kgの容量でラット用胃ゾンデを用いて1日1回，28日間の計28回，強制的に胃内に投与した．

4.　検査項目

1)　一般状態観察

投与期間および回復期間中，全例について1日1回以上の頻度で観察した．

2)　体重および摂餌量測定

体重は全例について，投与1日(投与前)，投与2，7，14，21および28日(投与終了日)，回復1，7および14日ならびに剖検日に測定し，投与1日から28日，回復1日から14日の体重増加量および体重増加率を算出した．また，摂餌量は剖検日を除いて体重と同じ日に測定した．

3)　尿検査および飲水量測定

投与4週および回復2週に全例を代謝ケージに収容して非絶食下で採尿を行い，同時に採尿中の飲水量(重量)も測定した．約3時間の蓄尿についてpH，蛋白，糖，ケトン体，ウロビリノーゲン，ビリルビン，潜血反応(以上，マルティスティックス，バイエル・三共)および色調(肉眼観察)ならびに沈渣(鏡検)を検査し，21時間蓄尿について尿量(容量)，比重(屈折計法，アタゴ)を測定した．

4)　血液学検査

全例について剖検時に16〜20時間絶食させた後，エーテル麻酔下で腹部大動脈より採血し，EDTA・2Kで処理した血液を用いて赤血球数，ヘマトクリット値，血小板数，白血球数(以上，電気抵抗法)，ヘモグロビン量(シアンメトヘモグロビン法)，平均赤血球容積(赤血球数，ヘマトクリット値より算出)，平均赤血球ヘモグロビン量(赤血球数，ヘモグロビン量より算出)，平均赤血球ヘモグロビン濃度(ヘマトクリット値，ヘモグロビン量より算出)，(以上，自動血球計数装置F-820，シスメックス)，網赤血球数(Brecher法)および白血球百分比(May-Grnwald-Giemsa染色)を測定した．また，3.8 %クエン酸ナトリウムで処理した後，3000回転/分で10分間遠心分離して得られた血漿を用いて，プロトロンビン時間(トロンボプラスチン法)および活性化部分トロンボプラスチン時間(エラジン酸法)(以上，血液凝固自動測定装置アメルングKC-10A，バクスター)を測定した．

5)　血液生化学検査

血液学検査と同時に，全例について腹部大動脈より採血し，ヘパリン処理した後，3000回転/分で10分間遠心分離して得られた血漿を用いてGOT(IFCC法)，乳酸脱水素酵素(Wrblewski & La Due法)およびグルコース(ヘキソキナーゼ法)を測定し，無処理血液を3000回転/分で10分間遠心分離して得られた血清を用いてGPT(IFCC法)，アルカリホスファターゼ(Bessey-Lowry法)，γ-GTP(包接L-γ-グルタミル-ρ-ニトロアニリド基質法)，総コレステロール(酵素法)，トリグリセリド(遊離グリセロール消去法)，総ビリルビン(アゾビリルビン法)，尿素窒素(ウレアーゼ・インドフェノール法)，クレアチニン(Jaff法)，カルシウム(OCPC法)，無機リン(Fiske-SubbaRow法)，総蛋白(ビウレット法)(以上，自動分析装置7150形，日立製作所)，ナトリウム，カリウム(以上，炎光光度法，自動炎光光度計480型，コーニング)，クロール(電量滴定法，クロライドカウンターCL-6M，平沼産業)，蛋白分画およびA/G比(以上，セルロースアセテート膜電気泳動法，全自動電気泳動装置CTE-150，常光)を測定した．

6)　剖検および器官重量測定

投与28日および回復14日の翌日に全例について，体外表を観察し，エーテル麻酔下で採血後放血致死させ剖検した．また，脳，肺，心臓，肝臓，腎臓，脾臓，副腎，下垂体，胸腺，甲状腺(上皮小体含む)，精巣，精巣上体および卵巣の重量を測定するとともに，絶対重量を剖検当日の体重で除し100を乗じて相対重量を算出した．

7)　病理組織学検査

全例について脳(大脳および小脳)，下垂体，胸腺，甲状腺，上皮小体，副腎，脾臓，心臓，胸部大動脈，舌，食道，胃(前胃および腺胃)，肝臓，膵臓，十二指腸，空腸，回腸(パイエル板含む)，盲腸，結腸，直腸，喉頭，気管，肺(気管支含む)，腎臓，膀胱，前立腺，精嚢(凝固腺含む)，卵巣，子宮(角部および頸部)，膣，乳腺(原則として右腹部，雌のみ)，皮膚(腹部)，胸骨(骨髄含む)，大腿骨(骨髄含む)，脊髄(頸部)，骨格筋(大腿部)，腸間膜リンパ節，下顎リンパ節，顎下腺，舌下腺，耳下腺および坐骨神経を10 %中性緩衝ホルマリン液で，眼球およびハーダー腺をデビッドソン液で固定・保存し，精巣および精巣上体をブアン液で固定後70 %エタノールで保存した．これらの器官・組織を常法に従ってパラフィン包埋後，薄切してヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製して対照群および高用量群について鏡検し，前胃については全例鏡検した．

5.　統計解析

体重，体重増加量および増加率，摂餌量，尿検査の定量的項目，血液学検査，血液生化学検査，器官の絶対重量および相対重量の成績について，Bartlettの検定法によって等分散性を解析し，等分散の場合は，一元配置分散分析法で解析し，有意差がみられた場合は，Dunnettの検定法により解析した．不等分散の場合は，Kruskal-Wallis法で解析し，有意差がみられた場合は，Mann-WhitneyのU-検定法を用いて解析した．

尿比重および尿検査の定性的項目の成績については，Kruskal-Wallisの検定法で解析し，有意差がみられた場合はMann-WhitneyのU-検定法を用いて解析した．

これら対照群と被験物質投与群との間の検定においては，いずれも有意水準を5 %とした．

結果

1.　一般状態

1000 mg/kg投与群の雌雄で，投与期間中によろめき歩行，腹臥，横臥，振戦が散見され，他に外尿道口周囲の被毛の汚れも散見されたが，回復期間中には認められなかった．

2.　体重

1000 mg/kg投与群の雄で，投与2および7日に一過性の低体重が認められたが，雌では各投与群とも変化は認められなかった．

3.　摂餌量

1000 mg/kg投与群の雄で，投与2日に一過性の低値が認められたが，雌では各投与群とも変化は認められなかった．

4.　尿検査および飲水量

1000 mg/kg投与群の雌雄で飲水量および尿量の増加が認められた．300 mg/kg投与群の雄でも尿量の増加がみられたが，背景データの範囲内であることから，被験物質との関連性はないと考えられた．また，300 mg/kg以上の投与群の雌雄で尿蛋白の低下がみられたが，臨床的な診断意義に乏しいことから毒性学的意義のない変化と考えられた．

5.　血液学検査(Table 1, 2)

100および1000 mg/kg投与群の雄で，ヘモグロビン量，赤血球数およびヘマトクリット値に高値あるいは高値傾向がみられたが，明らかな投与量依存性がないことから，被験物質との関連性はないと考えられた．また回復期間終了時に1000 mg/kg投与群の雄でプロトロンビン時間の延長が認められたが，投与期間終了時と同程度の数値であり，毒性学的意義はないと考えられた．

6.　血液生化学検査(Table 3, 4)

300 mg/kg投与群の雄で，カルシウムの高値が認められたが，投与量依存的ではなかった．

1000 mg/kg投与群の雌雄でGPTの高値，雌で総コレステロールの高値が認められた．雄でクロールの低値がみられたが，腎臓に病理組織学的変化がないことから毒性学的意義はないと考えられた．また雄でγ-GTPの高値もみられたが，いずれも対照群の上限を超える値ではなく，測定誤差範囲内の値であった．回復期間終了時に1000 mg/kg投与群の雌でナトリウムの低値がみられたが，これも毒性学的意義はないと考えられた．

7.　剖検

1000 mg/kg投与群の雌雄に前胃の境界縁の肥厚がみられたが，回復期間終了時には認められなかった．

300 mg/kg投与群の雄1例に肝臓の黄白色斑がみられたが，投与量依存的でないことから，被験物質との関連はないと考えられた．

8.　器官重量(Table 5, 6)

1000 mg/kg投与群の雌雄に肝臓の相対重量の高値がみられ，雌では絶対重量も高値を示した．また，雄の腎臓の相対重量も高値を示した．回復期間終了時に1000 mg/kg投与群の雌で胸腺の絶対重量の低値がみられたが，相対重量には差がなかった．

9.　病理組織学検査(Table 7)

1000 mg/kg投与群の雌雄で前胃の境界縁に軽度な扁平上皮の過形成が全例にみられ，前胃のその他の部位にも半数例に認められた．回復期間終了時にも1000 mg/kg投与群の雌1例に前胃の境界縁とその他の部位に軽度な扁平上皮の過形成が認められたが，同群のその他の例には雌雄とも変化は認められず，回復性が認められた．

考察

一般状態では，1000 mg/kg投与群の雌雄で投与期間中に横臥あるいは腹臥，よろめき歩行および外尿道口周囲の被毛の汚れが散見されたが，回復期間中には認められなかった．この症状は急性経口投与毒性試験 1)でも観察されたことから3-エチルフェノール投与により発現した急性症状と考えられた．

体重および摂餌量では，1000 mg/kg投与群の雄で投与2および7日に低値がみられ，3-エチルフェノール投与に起因した変化と考えられたが，この低値は投与期間中に軽減したことから，3-エチルフェノールの体重および摂餌量に及ぼす影響は軽度なものと考えられた．

尿検査では，1000 mg/kg投与群で雌雄とも飲水量および尿量の増加がみられ，3-エチルフェノール投与との関連が考えられた．この飲水量および尿量の増加は，3-アミノフェノール，4-エチルフェノールまたはm-クレゾールの28日間反復経口投与毒性試験でも認められていることから，これらのフェノール類に共通の変化と考えられた．投与4週にみられたこれらの変化は回復2週には認められず，可逆性の変化と考えられた．

血液生化学検査では，投与期間終了時に1000 mg/kg投与群で雌雄ともにGPTの増加および雌に総コレステロールの増加が認められた．この変化は用量設定試験でも認められ，3-エチルフェノール投与に起因する変化と考えられた．GPTおよび総コレステロールの増加は3-アミノフェノールおよび4-エチルフェノールの28日間反復経口投与毒性試験の高用量群でも認められていることから，これらのフェノール類に共通の変化と考えられた．しかし回復期間終了時には認められないことから，可逆性の変化と考えられた．

剖検では，1000 mg/kg投与群の雌雄ともに前胃の境界縁の肥厚が認められ，病理組織学的には扁平上皮過形成が認められた．この変化は，急性経口投与毒性試験1)でみられた前胃粘膜の水腫様変化，前胃粘膜の暗赤色化，腺胃粘膜の暗赤色斑および腺胃粘膜の菲薄化等との関連が考えられ，3-エチルフェノールの直接的な刺激作用に起因する変化と考えられた．また，回復期間終了時には1例にのみ前胃の扁平上皮過形成が認められ，その他の例では認められなかったこと，この1例は投与期間終了後に全身状態の悪化が認められ，回復が遅延していたとも考えられることから，この変化は可逆性の変化であると考えられた．

器官重量では，1000 mg/kg投与群で雌雄に肝臓の絶対重量あるいは相対重量の高値が認められ，また雄では腎臓の相対重量の高値も認められ，3-エチルフェノール投与に起因する変化と考えられた．

以上のことから，本試験条件下における3-エチルフェノールの無影響量(NOEL)は雌雄とも300 mg/kg/dayと考えられた．

文献

1)須永昌男他，化学物質毒性試験報告，8, 747(2001).

連絡先
試験責任者：須永昌男
試験担当者：堀川裕尚，咲間正志，山本美代子，平田真理子，古川正敏
(株)化合物安全性研究所
〒004-0839　札幌市清田区真栄363番24
Tel 011-885-5031Fax 011-885-5313

Correspondence
Authors:Masao Sunaga(Study director)
Hironao Horikawa, Masashi Sakuma, Miyoko Yamamoto, Mariko Hirata, Masatoshi Furukawa
Safety Research Institute for Chemical Compounds Co., Ltd.
363-24 Shin-ei, Kiyota-ku, Sapporo, Hokkaido, 004-0839, Japan
Tel +81-11-885-5031Fax +81-11-885-5313