2,4-ジクロロニトロベンゼンの
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を
用いる染色体異常試験

In Vitro Chromosomal Aberration Test of
2,4-Dichloronitrobenzene on Cultured Chinese Hamster Cells

要約

　OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として，2,4-ジクロロニトロベンゼンの培養細胞に及ぼす細胞遺伝学的影響を評価するため，チャイニーズ・ハムスター培養細胞（CHL/IU）を用いて試験管内染色体異常試験を実施した．

　連続処理（24および48時間），短時間処理（6時間）ともに，50%を越える増殖抑制濃度，すなわち0.14 mg/mlの濃度を最高処理濃度とした．最高処理濃度の 1/2 および1/4をそれぞれ中濃度，低濃度として設定した．連続処理として，S9 mix非存在下における24時間および48時間連続処理，短時間処理としてS9 mix 存在下および非存在下で6時間処理（18時間の回復時間）後，標本を作製し，検鏡することにより染色体異常誘発性を検討した．

　CHL/IU 細胞を24時間連続処理した高濃度群（0.14 mg/ml）において，構造異常の統計学的に有意な増加が認められたが，その頻度は4%で生物学的には陰性と判定した．また，24時間連続処理した中濃度群（0.07 mg/ml）および48時間連続処理した高濃度群（0.14 mg/ml）において，倍数性細胞の有意な増加が認められたが，その頻度は3%未満で生物学的には陰性と判定した．連続処理したその他の処理群では，染色体の構造異常および倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

　短時間処理では，S9 mix 存在下および非存在下で6時間処理した高濃度群（0.14 mg/ml）においては，細胞毒性のため十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．一方， S9 mix 存在下および非存在下の中濃度群（0.07 mg/ml）において，倍数性細胞の有意な増加が認められたが，その頻度は2%未満で生物学的には陰性と判定した．

　以上の結果より，2,4-ジクロロニトロベンゼンは，上記の試験条件下で染色体異常を誘発しないと結論した．

方法

1．使用した細胞

　リサーチ・リソースバンク（JCRB）から入手（1988年2月，入手時：継代 4代，現在12代）したチャイニーズ・ハムスター由来のCHL/IU 細胞を，解凍後継代 10代以内で試験に用いた．

2．培養液の調製

　培養には，牛胎児血清（FCS：JRH BIOSCIENCES）を 10% 添加したイーグル MEM 培養液（日水製薬(株)）を用いた．

3．培養条件

　2×10^4 個のCHL/IU細胞を，培養液5 mlを入れたディッシュ (径 6 cm，Corning) に播き，37 ℃のCO2インキュベーター (5% CO2) 内で培養した．連続処理では，細胞播種3日目に被験物質を加え，24時間および48時間処理した．また，短時間処理では，細胞播種3日目にS9 mix存在下および非存在下で6時間処理し，処理終了後，新鮮な培養液で，さらに18時間培養した．

4．被験物質

　2,4-ジクロロニトロベンゼン（略号：DCNB，CAS No. ：611-06-3，ロット番号：930812，石原産業(株)製造，(社)日本化学工業協会提供）は，黄色の固体で，水に不溶，アセトンおよびジメチルスルホキシド（DMSO）に易溶，沸点258.5℃，蒸気圧12 mmHg（131℃），融点33℃，比重1.439（80℃），分子式 Cl2C6H3NO2，分子量 192.00，純度 99.6%で，可燃性を有する物質である．被験物質原体は安定であり，溶媒中（DMSO）では，7.00〜28.0 mg/ml の濃度範囲で4時間は安定であった．

5．被験物質の調製

　被験物質の調製は，使用のつど行った．溶媒はDMSO（Sigma Chemical Co., および和光純薬(株)）を用いた．原体を溶媒に溶解して原液を調製し，ついで原液を溶媒で順次希釈して所定の濃度の被験物質調製液を作製した．被験物質調製液は，すべての試験において培養液の 0.5% (v/v) になるように加えた．染色体異常試験に用いた被験物質調製液の濃度は，許容範囲内（溶媒中での平均含量が添加量の90.0〜110%）の値であった．なお，濃度の記載について，純度換算は行わなかった．

6．細胞増殖抑制試験による処理濃度の決定

　染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため，被験物質の細胞増殖に及ぼす影響を調べた．被験物質の CHL/IU 細胞に対する増殖抑制作用は，単層培養細胞密度計（MonocellaterTM，オリンパス光学工業(株)）を用いて各群の増殖度を計測し，被験物質処理群の溶媒対照群に対する細胞増殖の比をもって指標とした．

　その結果，50%を明らかに越える増殖抑制濃度（約60%の増殖抑制濃度）を，60%の増殖抑制濃度をはさむ2点の値より算出したところ，連続処理では0.12 mg/ml ，短時間処理のS9 mix 存在下およびS9 mix非存在下では，それぞれ 0.14 mg/ml および 0.13 mg/mlであった（Fig. 1）． また，被験物質を 0.48 mg/ml以上の濃度で処理すると，増殖抑制を示さないような値が得られた．これは被験物質によってディッシュ底面が溶解したため，透過率が変わったことによると考えられる．

7．実験群の設定

　細胞増殖抑制試験の結果より，染色体異常試験で用いる被験物質の高濃度群を，連続処理，短時間処理とも 0.14 mg/ml とし，それぞれ高濃度群の 1/2 の濃度を中濃度，1/4 の濃度を低濃度とした．陽性対照物質として用いたマイトマイシンC（MC，協和醗酵工業(株)）およびシクロホスファミド（CPA，Sigma Chemical Co.）は，注射用水（(株)大塚製薬工場）に溶解して調製した．それぞれ染色体異常を誘発することが知られている濃度を適用した．

8．染色体標本作製法

　培養終了の 2時間前に，コルセミドを最終濃度が約 0.1 μg/ml になるように培養液に加えた．染色体標本の作製は常法に従って行った．スライド標本は各ディッシュにつき6枚作製した．作製した標本を3%ギムザ液で染色した．

9．染色体分析

　作製したスライド標本のうち，1つのディッシュから得られた異なるスライドを，4名の観察者がそれぞれ処理条件が分からないようにコード化した状態で分析した．染色体の分析は，日本環境変異原学会，哺乳動物試験（MMS）分科会1）による分類法に基づいて行い，染色体型あるいは染色分体型のギャップ，切断，交換などの構造異常の有無と倍数性細胞（polyploid）の有無について観察した．また構造異常については， 1群 200個，倍数性細胞については 1群 800個の分裂中期細胞を分析することとした．

10．記録と判定

　無処理対照，溶媒および陽性対照群と被験物質処理群についての分析結果は，観察した細胞数，構造異常の種類と数，倍数性細胞の数について集計し，各群の値を記録用紙に記入した．染色体異常を有する細胞の出現頻度について，フィッシャーの exact probability test 法により，溶媒対照群と被験物質処理群間および溶媒対照群と陽性対照群の有意差検定（p＜0.05）を行った．被験物質の染色体異常誘発性についての判定は，石館ら2)の判定基準に従い，染色体異常を有する細胞の頻度が 5% 未満を陰性，5% 以上 10% 未満を疑陽性，10% 以上を陽性とした．

結果および考察

　連続処理による染色体分析の結果を Table 1 に示した．

　2,4-ジクロロニトロベンゼンを加えて 24時間連続処理した高濃度群（0.14 mg/ml）において，染色体の構造異常の有意な増加（p=0.0184）が認められたが，異常を有する細胞の出現頻度が4%（gapを含む）であることから，生物学的には陰性と判断した．また，中濃度群（0.07 mg/ml）において，倍数性細胞の有意な増加（p=0.0103）が認められたが，その頻度は5%未満であり，生物学的には陰性と判断した．その他の処理群では，染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．また，48時間連続処理した高濃度群（0.14 mg/ml）において，倍数性細胞の有意な増加（p=2.50×10^-6）が認められたが，その頻度は5%未満であり，生物学的には陰性と判断した．その他の処理群では染色体の構造異常や倍数性細胞の誘発作用は認められなかった．

　短時間処理による染色体分析の結果を Table 2 に示した．

　2,4-ジクロロニトロベンゼンを加えて S9 mix存在下および非存在下で6時間処理した高濃度群（0.14 mg/ml）において，細胞毒性のため十分な細胞数を分析できなかったが，その他の処理群では，染色体の構造異常の誘発作用は認められなかった．一方，S9 mix存在下および非存在下の中濃度群（0.07 mg/ml）において，倍数性細胞の有意な増加（それぞれp=0.0171およびp=0.0454）が認められたが，その頻度は5%未満であり，生物学的には陰性と判断した．

　従って，2,4-ジクロロニトロベンゼンは，上記の試験条件下で，試験管内の CHL/IU細胞に染色体異常を誘発しないと結論した．

文献

1)日本環境変異原学会・哺乳動物試験分科会編, "化学物質による染色体異常アトラス," 朝倉書店, 東京, 1988.
2)石館　基　監修, "〈改訂〉染色体異常試験データ集," エル・アイ・シー社, 東京, 1987.

連絡先
試験責任者：田中憲穂
試験担当者：山影康次，若栗　忍，中川ゆづき，
日下部博一，橋本恵子
(財)食品薬品安全センター秦野研究所
〒257　神奈川県秦野市落合729-5
Tel. 0463-82-4751Fax 0463-82-9627

Correspondence
Authors:Noriho Tanaka ( Study director )
Kohji Yamakage, Shinobu Wakuri,
Yuzuki Nakagawa, Hirokazu Kusakabe,
Keiko Hashimoto
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center
729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa, 257, Japan
Tel. +81-463-82-4751Fax +81-463-82-9627