4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムの
ラットを用いた経口投与による28日間の反復投与毒性試験

28-Day Repeated Dose Oral Toxicity Study of Monosodium 4-amino-5-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonate in Rats

要約

4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムの毒性を明らかにするため、SD系〔Crj:CD(SD)〕ラットに、本物質の0（溶媒投与の対照、雌雄各12匹）、30（各6匹）、100（各6匹）、300（各6匹）および1,000 mg/kg/日（各12匹）用量を28日間にわたって強制経口投与した。また、対照および1,000 mg/kg群の雌雄各6匹については、投与終了後14日間の回復期間を設け、変化の可逆性についても検討した。30、100および300 mg/kg群では、一般状態の観察、体重および摂餌量の測定、尿検査並びに血液学的、血液生化学的および病理学的諸検査において、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウム投与の影響と考えられる変化は認められなかった。1,000 mg/kg群においても、単なる内容物の増加による盲腸の軽度な拡張例が雌雄に認められたが、投与期間終了後屠殺動物および回復期間終了後屠殺動物とも、明かな毒性影響と考えられる変化は認められなかった。したがって、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムのラット28日間反復経口投与における無影響量は、1000 mg/kg/日と推定された。

緒言

この試験は、厚生省の既存化学物質安全性点検事業の一環として実施したものであり、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムをラットに28日間反復経口投与し、現れる生体の機能および形態の変化を観察し、本物質の反復投与毒性を検討したので、その結果を報告する。

方法

1.被験物質

4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムは、分子量341.30（無水）の水にやや溶けにくい淡褐色の粉末で、試験には東京化成工業株式会社（東京）から提供されたもの（ロット番号AZ01）を用いた。供試された4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムの純度は87.4 %（無水物として）で、残部は結晶水や付着水などの水分であったことから、使用に当たっては純度換算した。投与終了後、被験物質を分析し、投与期間中安定であったことを確認した。

2.供試動物および飼育条件

動物は、日本チャールス・リバー（株）より導入したSD系〔Crj : CD(SD)〕ラットを、雌雄各42匹用いた。各群の動物数は、雌雄それぞれ対照および1,000 mg/kg群は12匹、30、100および300 mg/kg群は6匹とし、このうち対照および1,000 mg/kg群の雌雄各6匹は投与期間終了後14日間の回復試験を行うための回復群に当てた。各群への動物の割り付けは、投与開始日の体重に基づく層化無作為抽出法を用いて行った。投与開始時の平均体重（体重範囲）は、雄179（170〜188）g、雌143（131〜156）gであった。動物の飼育は、馴化、投与および回復期間とも、温度22±3℃、湿度55±10%、換気回数10回以上／時（オールフレッシュエアー方式）、照明12時間（午前6時点灯、午後6時消灯）に設定したバリアーシステム動物室で、ステンレス製金網ケージに各3匹ずつ雌雄別に収容して行った。飼料〔日本農産工業（株）、固型飼料ラボMRストック〕と水（1μmカートリッジフィルター濾過後紫外線照射した殺菌水道水）は、それぞれ給餌器および自動給水装置により自由摂取させた。

3.投与量および投与方法

投与量は、14日間反復投与による投与量設定試験の結果に基づいて、高用量を毒性試験法ガイドラインにおける上限量の1,000 mg/kg/日とし、以下300、100および30 mg/kg/日用量と、溶媒のみ投与の対照を設定した。被験物質は、メチルセルロース〔和光純薬工業（株）、100cP〕の1 w/v %水溶液〔水は共栄製薬（株）、局方精製水〕を溶媒とし、体重1kg当たりの投与液量が5mlで、純度換算量が所定の投与用量になるような濃度〔30 mg/kg群：0.686（純度換算濃度0.6）w/v % ; 100 mg/kg群：2.29（同2）w/v % ; 300 mg/kg群：6.86（同6) w/v % ; 1,000 mg/kg群：22.9（同20）w/v %〕の溶液又は、中および高濃度では懸濁液として調製した。投与は、胃ゾンデを装着した注射筒を用いて、1日1回、28日間にわたって強制的に経口投与した。各個体の投与液量は週1回の測定体重に基づいて算出した。投与液中の被験物質は均一に分散し、また冷所遮光下で少なくとも7日間は安定であることが確認されているので、調製した投与液の使用期間は7日以内とし、使用直前まで各濃度ごとに小分けして冷所遮光（　4℃）下に保管した。さらに、実際に用いた投与液について濃度分析し、所定の濃度に調製されていることを確認した。

4.観察および検査項目

1)一般状態観察

投与および回復期間中毎日、生死および外観、行動等を観察した。

2)体重および摂餌量測定

体重は、個体ごとに投与開始日（投与開始直前）およびその後は毎週1回測定した。摂餌量は、ケージごとに毎週1回、24時間の消費量を測定し、1匹あたりの平均摂餌量を算出した。

3)尿検査

投与開始25日（雄）又は27日（雌）、並びに投与終了後14日（雄）又は13日（雌）に腰背部を圧迫刺激して強制排尿させ、pH、潜血、タンパク、糖、ケトン体、ビリルビンおよびウロビリノーゲン〔以上、マイルス・三共（株）、マルティスティックス(R)〕、並びに外観を検査した。

4)血液学的検査

供試血液の採取は、投与期間および回復期間終了翌日における屠殺剖検時に行った。動物は採血前日の午後5時より除餌し、水のみを給与した。採血は、エーテル麻酔下で開腹して腹大動脈より行った。採取した血液は3分割し、その一部はEDTA-2Kで凝固阻止処理し、多項目自動血球計数装置〔東亜医用電子（株）、E-4000〕により、赤血球数（電気抵抗検出方式）、血色素量（オキシヘモグロビン法）、ヘマトクリット値（パルス検出方式）、平均赤血球容積、平均赤血球血色素量、平均赤血球血色素濃度（以上、計算値）、白血球数および血小板数（以上、電気抵抗検出方式）を、また塗抹標本を作製して、網状赤血球数（Brilliant cresyl blue染色）および白血球百分率（May-Giemsa染色）を測定した。さらに一部の血液を3.8%クエン酸ナトリウム処理して血漿を得、血液凝固自動測定装置（アメルング社、KC-10A）により、プロトロンビン時間（Quick一段法）および活性化部分トロンボプラスチン時間（エラジン酸活性化法）を測定した。

5)血液生化学的検査

採取した血液の一部から血清を分離し、生化学自動分析装置〔日本電子（株）、JCA-VX-1000型クリナライザー〕により、総タンパク（Biuret法）、アルブミン（BCG法）、A/G比（計算値）、血糖、トリグリセライド、総コレステロール（以上、酵素法）、総ビリルビン（Jendrassik法）、尿素窒素（Urease-UV法）、クレアチニン（Jaffe法）、GOT、GPT、γ-GTP（以上、SSCC法）、アルカリフォスファターゼ（GSCC法）、カルシウム（OCPC法）および無機リン（酵素法）を、また電解質自動分析装置〔東亜電波工業（株）、NAKL-1〕により、ナトリウム、カリウムおよび塩素を測定した。

6)病理学的検査

(1)剖検

採血後に放血屠殺し、剖検を行った。

(2)臓器重量測定

脳、肝臓、腎臓、副腎、精巣又は卵巣を秤量（絶対重量）し、屠殺日の体重をもとに対体重比（相対重量）を算出した。腎臓、副腎、精巣および卵巣は、左右を一括して秤量した。

(3)病理組織学的検査

対照群および1,000 mg/kg群の心臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎および盲腸について、10%中性リン酸緩衝ホルマリン液で固定後、常法によりパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（H-E）染色を施して鏡検した。

5.統計処理

得られた平均値あるいは頻度について、対照群との間の有意差（危険率5%以下）を次の方法で検定した。すなわち、3群以上の場合、定量的所見についてはBartlettの分散検定を行い、分散が一様な場合は一元配置の分散分析を行った。分散が一様でない場合、白血球百分率および尿所見はKruskal-Wallisの順位検定を行った。それらの結果有意差を認めた場合、Dunnett法により対照群に対する各群の比較検定を行った。また、剖検および病理組織学的所見についてはχ^2検定を用いた。一方、2群の場合、定量的所見についてはF検定を行い、その結果分散が一様な場合はStudentの t 検定を、一様でない場合はAspin-Welchの t 検定を行った。また、白血球百分率および尿所見についてはMann-WhitneyのU検定を、剖検および病理組織学的所見については、Fisherの直接確率法を用いた。摂餌量については、ケージごとの量を測定するので各群における測定値の数が少なく、有意差検定は実施しなかった。

結果

1.一般状態および死亡

対照群並びに30、100、300および1,000 mg/kg群の雌雄とも、観察期間を通じて一般状態の変化や死亡は認められなかった。

2.体重（Figure 1）

投与および回復期間を通じて、被験物質投与各群の体重は、対照群と比べて統計学的に有意な差は認められなかった。雌の回復期間終了後屠殺動物において、1,000 mg/kg群の体重は投与終了時から対照群をやや下回っていたが、回復期間中両群の体重はほぼ平行して推移し、変動は認められなかった。

3.摂餌量

投与および回復期間を通じて、被験物質投与各群の摂餌量は対照群と比べて差は認められなかった。

4.尿所見

投与期間および回復期間終了前のいずれの検査においても、各検査項目に4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウム投与の影響が考えられる変化は認められなかった。投与期間終了前の1,000 mg/kg群の雄のpHは、やや酸性に傾く傾向が認められたが、統計学的に有意な変化ではなかった。投与期間終了前の検査において、ビリルビンおよびウロビリノーゲン検査用試薬は100 mg/kg以上の用量群の被験尿に対し、本来の呈色反応（ビリルビン：淡褐色；ウロビリノーゲン：桃色）とは異なる色調（ビリルビン:赤紫色；ウロビリノーゲン:橙黄色）に発色し、判定が困難であった。この発色は、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウム水溶液（100 ppm）に対しても発現することが確認された。

5.血液学的所見（Table1, 2）

投与期間および回復期間終了後屠殺動物を通じて、被験物質投与各群の雌雄とも、各検査項目に対照群と比べて統計学的に有意な変化は認められなかった。

6.血液生化学的所見（Table 3,4）

投与期間終了後屠殺動物において、雌雄とも1,000 mg/kg群の総ビリルビン量のみが対照群と比べ高値を示し、統計学的有意差が認められた。ビリルビン検査用試薬で被験物質水溶液（0.1〜1000ppm）を検査した結果、被験物質の濃度に依存して試薬が反応することが確認された。回復期間終了後屠殺動物では、投与期間終了後屠殺動物で認められたビリルビンの変化は認められなかった。しかし、これとは別に、1,000 mg/kg群において、いずれも軽度なアルブミン量の減少およびそれに伴うA/G比の低下が雄に、無機リン量の減少が雌に認められた。

7.病理学的所見

1)剖検所見

投与期間終了後屠殺動物において、30、100および300 mg/kg群では、被験物質投与の影響がうかがわれる異常は認められなかった。1,000 mg/kg群では、盲腸の軽度な拡張が各6匹中雄の2匹と雌の4匹に認められた。回復期間終了後屠殺動物においては、異常は認められなかった。

2)臓器重量（Table 5,6）

投与期間終了後屠殺動物において、被験物質投与各群の測定した各臓器の重量は、絶対および相対重量のいずれにおいても、対照群に比べて統計学的に有意な変化は認められなかった。回復期間終了後屠殺動物においては、雌において1,000 mg/kg群の体重が対照群をやや下回ったため、副腎は絶対重量のみの減少、脳は相対重量のみの増加を示したが、絶対および相対重量に共通して一定の変化傾向を示す臓器は認められなかった。

3)病理組織学的所見（Table 7）

対照群および1,000 mg/kg群の雌雄について、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および副腎を検査した。また、剖検で盲腸の拡張が認められたので盲腸についても検査した。その結果、観察した各臓器に、被験物質投与の影響が考えられる変化は認められなかった。肉眼的に拡張していた盲腸は、粘膜や筋層の進展はみられたが病的異常は認められなかった。

考察

4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムのラットを用いた経口投与による28日間の反復投与毒性試験を、0（対照）、30、100、300および1,000 mg/kg群の5群で行った。また、対照群および1,000 mg/kg群については、投与期間終了後14日間の回復期間を設け、変化の可逆性についても検討した。

投与期間終了後屠殺動物において、30、100および300 mg/kg群では、雌雄とも被験物質投与の毒性影響と考えられる変化は認められなかった。1,000 mg/kg群においても、病理組織学的変化を伴わない単純な盲腸の拡張例が雌雄に認められたのみで、その他特に変化は認められなかった。

明らかな病理組織学的変化を伴わない盲腸の拡張は、抗菌性物質や高分子化合物のラットやウサギなどの盲腸の大きな動物種への投与時にしばしば認められ、腸内細菌叢の乱れによる変化と考えられている。

被験物質投与による盲腸拡張の発現機序については不明であるが、いずれにしても単なる盲腸内容物の増加による軽度な変化であり、下痢等の一般状態の変化や成長に対する影響は認められていないことから、生物学的にも毒性学的にも特に問題となるような変化ではないと判断される。

なお、尿中ビリルビンおよびウロビリノーゲンの定性的検査において、100 mg/kg以上の用量群の雌雄の尿に対し判定基準にない色調の呈色反応が現れ、判定が困難であった。また、血液生化学的検査において、関連する変化を伴わないビリルビン量のみの高値が1,000 mg/kg群の雌雄に認められた。

ビリルビンについては、尿および血清用検査試薬ともジアゾ試薬を用いており、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムはナフトール誘導体であることから、このジアゾ試薬と容易に反応することは当然考えられる。また、Ehrlich反応を応用した尿中のウロビリノーゲンの定性的検査についても、Ehrlich試薬は古くからアミノ基や活性メチレンの発色試薬として用いられており、ナフチルアミン誘導体である被験物質に対しても反応することは十分予想される。これらのことは、被験物質水溶液に対して、これらの試薬が反応したことにより確認された。

したがって、尿試験におけるビリルビンやウロビリノーゲン検査試薬による発色や血清ビリルビンの高値は、尿中あるいは血中の被験物質およびその代謝物と試薬との反応成績体によるものと考えられ、被験物質の毒性影響を示唆する変化ではないと判断された。

一方、回復期間終了後屠殺動物では、投与期間終了後屠殺動物で認められた盲腸の拡張は認められず、回復していた。

これとは別に、回復期間終了後屠殺動物の1,000 mg/kg群において、いずれも血清アルブミン量の減少およびそれに伴うA/G比の低下が雄に、無機リン量の減少が雌に認められたが、いずれも軽度、かつ、当研究所におけるバックグランドデータからみて生理的範囲内の変動であり、他に関連する変化も認められないことから、被験物質投与と関連付けるのは困難であった。さらに、1,000 mg/kg群の雌における脳の相対重量増加と副腎の絶対重量減少についても、絶対および相対重量に共通して一定の変化傾向を示すものではなく、体重が対照群をやや下回ったことに伴う二次的な変化と判断される。

このように、4−アミノ−5−ヒドロキシ−2, 7−ナフタレンジスルホン酸モノナトリウムはラットへの28日間反復投与において、1,000 mg/kg群においても特に問題となるような毒性影響は認められなかった。したがって、無影響量（NOEL）は1,000 mg/kg/dayと推定された。

連絡先：
試験責任者伊藤義彦
（財）畜産生物科学安全研究所
〒 229 神奈川県相模原市橋本台 3-7-11
Tel 0427-62-2775Fax 0427-62-7979

Correspondence:
Ito, Yoshihiko
Research Institute for Animal Science in Biochemistry and Toxicology, Japan
3-7-11 Hashimotodai, Sagamihara-shi, Kanagawa, 229, Japan
Tel 81-427-62-2775Fax 81-427-62-7979