Amesの標準法では，検定菌として，Salmonella typhimurium TA100, TA1535, TA98, TA1537およびEscherichia coli WP2 uvrAを用い，直接法および代謝活性化のいずれも，用量設定試験は50〜5000μg/プレート，本試験では用量設定試験で抗菌性が認められなかったことから，312.5〜5000μg/プレートの用量で試験を実施した．
アゾ還元法では，検定菌として，S. typhimurium TA100およびTA98を用い，直接法および代謝活性化法のいずれも312.5〜5000μg/プレートの用量で試験を実施した． その結果，いずれの試験法においても，用いた検定菌について，いずれの用量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから，D&C Red No.7は，用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された．
E. coli WP2 uvrA株は1979年５月９日に国立遺伝学研究所の賀田恒夫博士から分与を受けた． 検定菌は，-80℃以下で凍結保存した．
試験に際して，ニュートリエントブロスNo.２（Oxoid）を入れたＬ字型試験管に種菌を接種し，37℃，約10〜12時間往復振とう培養したものを検定菌液とした．
D&C Red No.7は，ジメチルスルホキシド（以下DMSOと略：ロット番号：TWP 5445およびAPQ5928，和光純薬工業（株））を用いて50mg/mlになるように調製した後，同溶媒で更に公比２ないし３で希釈したものを，速やかに試験に用いた．なお，調製にあたって，純度換算は行わなかった． 秦野研究所においてD&C Red No.7のDMSO溶液中での安定性試験を行った．本試験における最高濃度（50mg/ml）および最低濃度（３mg/ml）の２濃度について，室温遮光条件下で実施した．その結果，調製後４時間における各３サンプルの平均含量は，それぞれ初期値（０時間）の平均に対して，98.1％および99.1％であった．
また，本試験に用いた調製検体について，含量測定試験を行った結果，50mg/ml溶液の含量は既定濃度に対し，96.2〜99.0％，3.125mg/ml溶液は，100〜102％であった．
以上の結果から，D&C Red No.7はDMSO溶液中では安定であり，また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された．
| AF-2 | ： | フリルフラマイド | （上野製薬（株）） |
| SA | ： | アジ化ナトリウム | （和光純薬工業（株）） |
| 9-AA | ： | 9-アミノアクリジン | （SigmaChem.Co.） |
| 2-AA | ： | 2-アミノアントラセン | （和光純薬工業（株）） |
| TB | ： | トリパンブルー | （MERCK） |
| （A） | バクトアガー（Difco） | 0.6％ |
| 塩化ナトリウム | 0.5％ | |
| （B）* | L-ヒスチジン | 0.5mＭ |
| ビオチン | 0.5mＭ |
| 硫酸マグネシウム・7水和物 | 0.2g |
| クエン酸・1水和物 | 2g |
| リン酸水素二カリウム | 10g |
| リン酸水素アンモニウムナトリウム・4水和物 | 3.5g |
| グルコース | 20g |
| バクトアガー（Difco） | 15g |
i）Amesの標準法
| S9** | 0.1ml |
| NADH | 4μmol |
| 塩化マグネシウム | 8μmol |
| NADPH | 4μmol |
| 塩化カリウム | 33μmol |
| 0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4） | 0.5ml |
| グルコース・6リン酸 | 5μmol |
| **： | ７週齢のSprague-Dawley系雄ラットをフェノバルビタール（PB）および5,6-ベンゾフラボン（BF）の 併用投与で酵素誘導して作製したS9（キッコーマン（株））を用いた． |
ii）アゾ還元法
| S9** | 0.3ml |
| NADH | 4μmol |
| 塩化マグネシウム | 8μmol |
| NADPH | 4μmol |
| 塩化カリウム | 33μmol |
| 0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4） | 1000μmol |
| グルコース・6リン酸 | 5μmol |
| FMN | 2μmol |
| ***： | 8週齢のSyrian Hamster（Std:Syrian）雄の無誘導肝より作製したS9（キッコーマン（株））を用いた． |
小試験管中にトップアガー２ml，被験物質調製液0.1ml，リン酸緩衝液0.5ml（代謝活性化試験においてはS9混液i）0.5ml），検定菌液0.1mlを混合したのち合成培地平板上に流して固めた．また，対照群として被験物質調製液の代わりにDMSO，または数種の陽性対照物質溶液を用いた．各検定菌ごとの陽性対照物質の名称および用量はTableに示した．培養は37℃で48時間行い，生じた変異コロニー数を算定し，それぞれその平均値と標準偏差を求めた．抗菌性の有無については，肉眼的あるいは実体顕微鏡下で，寒天表面の菌膜の状態から判断した．
小試験管中に検定菌液0.1ml，被験物質調製液0.1ml，リン酸緩衝液0.5ml（代謝活性化法においてはS9混液ii）0.5ml）を混合し，37℃で20分間プレインキュベーションを行ったのち２mlのトップアガーを加えて混和し，合成培地平板上に流し固めた．同時に，被験物質調製液のかわりに溶媒または２種の陽性対照物質溶液を用いて対照試験を行った．その後の操作はAmesの標準法と同じ方法で行った．
以上の結果から，本試験における最高用量を直接法，代謝活性化法ともに，すべての検定菌において，5000μg/プレートとし，公比２で，５用量を設定することとした．
| 1） | D. M. Maron, and B. N. Ames, Mutation Research. 113, 173-215（1983）. |
| 2） | M. J. Prival, and V. D. Mitchell, Mutation Research, 97 103-116 （1982）. |
| 3） | M. H. L. Green, "Handbook of Mutagenicity Test Procedures," （B. J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols, and C. Ramel eds.） Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford. 1984, pp.161-187. |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者： | 澁谷 徹 | ||
| 試験担当者： | 石原尚古，坂本京子，加藤基恵，原 巧， 川上久美子，松木容彦，北嶋美似子 | ||
| （財）食品薬品安全センター秦野研究所 | |||
| 〒257 神奈川県秦野市落合729-5 | |||
| Tel 0463-82-4751 | Fax 0463-82-9627 | ||
| Correspondence | |||
| Authors: | Tohru Shibuya （Study director）
Naoko Ishihara, Kyoko Sakamoto, Motoe Katoh, Takumi Hara, Kumiko Kawakami, Yasuhiko Matsuki, Miiko Kitashima | ||
| Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center | |||
| 729-5 Ochiai, Hadano-shi, Kanagawa, 257, Japan | |||
| Tel +81-463-82-4751 | Fax +81-463-82-9627 | ||
