1,2,3-Trimethylbenzene in Rats
ラットは 1群雌雄各5匹で4試験群,対照群および高用量群には雌雄各5匹の回復群を設け,計60匹を使用した.
1,2,3-トリメチルベンゼンは,コーン油に溶解し,0,100,300および1000 mg/kgを毎日1回,4週間連続経口投与し,一般状態の観察,体重測定,摂餌量測定,血液学検査,血液凝固検査,血液生化学検査,尿検査,器官重量測定および病理学検査を行った.なお,回復期間は2週間とし,投与終了時と同様な検査を実施した.
その結果は,次のとおりである.
一般状態の観察では,雌雄の 1000 mg/kg群で全例に流涎が認められたが,回復期間では発現がなかった.
体重は雌の 1000 mg/kg群で増加が抑制され,雄の同群で増加抑制傾向がみられた.摂餌量は,雌雄とも群間で差が認められず,飼料効率は雄の300 mg/kg,雌雄の 1000 mg/kg群で低値であった.
血液学検査では,被験物質投与の影響を示唆する変化は認められなかったが,血液凝固検査では,活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT)が雌雄の被験物質投与群で延長または延長傾向を示し,さらに,プロトロンビン時間(PT)が雄のすべての被験物質投与群,雌の300 mg/kg群で延長または延長傾向を示し,フィブリノーゲン量が雄の1000 mg/kg群で高値を示した.回復試験では雄の1000 mg/kg群でAPTTのみ影響が継続して認められたが,その他の変化には回復が認められた.
血液生化学検査の結果,雌雄のすべての被験物質投与群で GOTの低値,雌のこれらの群および雄の1000 mg/kg群で塩素の低値,さらに雌雄の1000 mg/kg群で総コレステロールの高値,雌の1000 mg/kg群で総蛋白の高値が認められた.これらの変化のうち,雌の1000 mg/kg群で認められた総蛋白の高値は,回復終了時の検査でも僅かに高値であった.
尿検査の結果,雌雄の 300および1000 mg/kg群で黄褐色尿が認められ,回復終了時の検査でも,雌雄の 1000 mg/kg群で各1例ずつ認められた.
器官重量測定の結果,雄では 300および1000 mg/kg群で腎臓,さらに1000 mg/kg群で肝臓の実重量および相対重量の高値が認められた.一方,雌では,300および1000 mg/kg群で胸腺の実重量の低値,さらに1000 mg/kg群で肝臓の実重量および相対重量の高値,脳の実重量の低値,相対重量の高値が認められた.回復終了時の測定では,これらの変化のうち,雄の1000 mg/kg群の腎臓相対重量の高値,雌の同群の胸腺実重量の低値が回復にまで至らなかった.
病理学検査の結果,被験物質の影響が示唆される病変として肉眼所見では投与終了時に腎臓の肥大および淡色化が雄の 300および1000 mg/kg群に,肝臓の肥大が雌の1000 mg/kg群に観察された.このうち腎臓の淡色化は雄の回復試験終了時にも観察された.
組織所見では投与終了時に肝細胞腫脹が雌雄の 1000 mg/kg群と雄の300 mg/kg群に,腎臓の硝子滴変性が雄の300および1000 mg/kg群に,石灰沈着などの変化が雄の1000 mg/kg群に観察された.腎臓の好酸性小体は雄で対照群から観察されたが,1000 mg/kg群で所見の程度の増強が観察されたほか,脾臓の鬱血が雌の1000 mg/kg群で観察された.
回復試験終了時には脾臓の色素沈着および赤血球系造血亢進が雌雄の 1000 mg/kg群に観察された.
以上のことから,無影響量は雌雄とも 100 mg/kg/day未満と判断され,低用量による追加試験を実施することとした.
なお,動物の馴化期間を含め,投与および回復期間中,データの信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因の変化はなかった.
従って, 28日間反復投与毒性試験の用量は予備試験と同様の0,100,300 および1000 mg/kgに設定した.
a. 血液学検査
EDTA-3Kを添加した初血を用い,白血球数(WBC:暗視野板法),赤血球数(RBC:暗視野板法),ヘモグロビン量(HGB:シアンメトヘモグロビン法),ヘマトクリット値(HCT:RBC, MCVより算出),平均赤血球容積(MCV:暗視野板法),平均赤血球血色素量(MCH:HGB, RBCより算出),平均赤血球血色素濃度(MCHC:HGB, HCTより算出),血小板数(PLT:暗視野板法)および白血球百分率(フローサイトケミストリー法)を血液自動分析装置THMS H・1E(米国マイルス社)を用いて測定した.
網赤血球 (RC)率算定用に,血液塗抹標本を作製しメイ・グリュンワルド・ギムザで染色後,鏡検した.
また,クエン酸ソーダ添加血液の血漿について,プロトロンビン時間 (Quick 1段法),活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)およびフィブリノーゲン量(トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国 Amelung社)を用いて測定した.
b. 血液生化学検査
血清を用いて,総蛋白
(ビューレット法),アルブミン(B.C.G.法),A/G比(計算値),血糖(グルコースオキシダーゼ法),中性脂肪(酵素法),総コレステロール(酵素法),尿素窒素(BUN:ウレアーゼアンモニア法),総ビリルビン(ジアゾ色素法),カルシウム(アルセナゾ�型Я破�),無機リン(モリブデン酸ブルー法),ナトリウム(電極法),カリウム(電極法)および塩素(電極法)をEKTACHEM 700N(米国コダック社)で,クレアチニン(Jaff
法),グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT:IFCC法),グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT:IFCC法),γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GTP:Szasz改法)およびアルカリホスファターゼ(ALP:Bessey-Lowry-Brock改良法)をCentrifiChem ENCORE��(米国ベーカー社)で測定した.
c. 尿検査
血液学検査に先立ち,採尿器を用いて 24時間(午前10時から翌日午前10時まで)尿を採取し,尿量,色調および濁度を検査後,尿比重計UR-S((株)アタゴ)を用いて尿比重を測定した.また,尿を遠心分離後Sternheimer変法により沈渣を染色し,鏡検した.pH,潜血,ケトン体,糖,蛋白,ビリルビンおよびウロビリノーゲンについて,N-マルティスティックスSG試験紙(マイルス・三共(株))およびCLINITEK 200(米国マイルス社)を用いて測定した.
病理組織学検査は固定した器官・組織のうち,肝臓,脾臓および腎臓はすべての群について,心臓,副腎,骨髄 (大腿骨)および唾液腺については対照群と高用量群について行った.常法に従って薄切標本を作製し,ヘマトキシリン・エオジン染色し鏡検した.
有意水準は 5および1%の片側検定で実施した.
雌では,対照群に比較して 100 mg/kg群で白血球数の高値,300 mg/kg群で低値が認められたが用量相関性のない変化であった.
雌では,対照群に比較してすべての被験物質投与群で GOTおよび塩素が低値を示し,さらに1000 mg/kg群で総コレステロールおよび総蛋白が高値を示した.
その他の検査項目は,雌雄とも対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.
雌では,対照群に比較して 300および1000 mg/kg群で胸腺重量が低値を示し,さらに1000 mg/kg群で脳重量が低値,肝臓重量が高値を示した.その他,100 mg/kg群でも脳重量が低値を示したが,用量相関性のない変化であった.
雌では,対照群に比較して 1000 mg/kg群で胸腺重量が低値を示した.
雌では,対照群に比較して 1000 mg/kg群で脳および肝臓相対重量が高値を示した.
雌では,対照群と 1000 mg/kg群で差が認められなかった.
回復試験終了時において,対照群に比較して被験物質投与群で多く観察された所見として,腎臓の淡色化が雄の 1000 mg/kg群で4例に観察された.その他観察された所見は,対照群,1000 mg/kg群でいずれも単発性の発生であった.
その他,観察された所見は単発性の発生にとどまった.
回復試験終了時において,対照群に比較して被験物質投与群で多く観察された所見として,脾臓の色素沈着が雌雄の 1000 mg/kg群で全5例に,赤血球系造血亢進が雌雄の1000 mg/kg群にそれぞれ雄全5例,雌2例に観察された.また,腎臓の好酸性小体が雄の1000 mg/kg群で3例に観察されたが,そのうちの1例には投与終了時と同様の重度の好酸性小体と蛋白円柱および管腔拡張も観察された.その他,肝臓の肉芽巣および脂肪化,腎臓の好塩基化および細胞浸潤が観察された.
その他,観察された所見は単発性の発生にとどまった.
雌雄とも摂餌量の増減は認められなかったが,体重が雌の 1000 mg/kg群で低値,雄の同用量群で低値傾向を示したため,これらの群では飼料効率が低値を示した.
血液学検査に関しては,病理組織学的検査で脾臓に赤血球系造血亢進が認められたが,被験物質投与の影響を示唆する変化は認められなかった.
血液凝固検査において,雌雄とも APTTに低用量の100 mg/kgから延長傾向または延長が認められ,雄ではPTも同様な傾向を示した.雄の1000 mg/kg群では,フィブリノーゲン量も高値を示しており,抗凝固薬や抗血小板薬で認められるものと同様な変化であったが,これらの薬剤で認められる血小板数の増加は本被験物質では認められていない.
血液生化学検査の結果,雌雄のすべての被験物質投与群で GOTの低値が認められた.
GOTはGPT同様逸脱酵素であり高値の場合のみ意義のある変化といわれている.GPTに関しては,セファロスポリン系抗生物質の投与で直接活性阻害を引き起こすことが知られているが4),GOTに関しての報告は見あたらず,本試験における他の諸検査の結果からもGOT低値の原因は明らかではない.その他雌雄で認められた総コレステロールおよび塩素,雌で認められた総蛋白についても変化の程度は僅かであり,特定器官の障害を明確に示唆するものではないと考えられた.
尿検査の結果,尿色の黄褐色化が認められたが,潜血やビリルビンなどの増加は認められなかった.被験物質の代謝物による色調変化が示唆されるが,回復期間終了時の検査でも雌雄各 1例に認められていることから,原因は明らかではない.
器官重量測定の結果,雌雄で肝臓重量の高値,さらに雄で腎臓重量の高値,雌で胸腺重量の低値が認められ,胸腺の変化を除き,病理学検査で重量増加の要因となる対応所見が認められた.
病理学検査の結果,被験物質投与の影響と考えられる変化として,肉眼所見では投与終了時の雄に腎臓の淡色化と肥大,雌に肝臓の肥大が観察され,回復試験終了時の雄にも腎臓の淡色化が観察された.その他の所見は自然発生性の所見と考えられた.組織所見では被験物質の影響と考えられる変化として,投与終了時の雌雄に中心性肝細胞腫脹,雄に腎臓の硝子滴変性が観察された.また被験物質投与によって,対照群にも観察された腎臓の好酸性小体の程度が増強し,それに伴って対照群には見られなかった腎臓の石灰沈着,蛋白円柱および管腔拡張が観察された.その他,各 1例のみであったが,1000 mg/kg群の雄に肝臓の糖質蓄積および脾臓の赤血球系造血亢進,雌に脾臓の鬱血が観察された.回復試験終了時の雌雄に脾臓の赤血球系造血亢進および色素沈着が観察された.逆に投与終了時の雌雄に肝臓の脂肪化の発生が減少した.また,投与終了時に雌の腎臓の肉眼的な肥大が観察されたが,組織学的には異常は認められなかった.その他の所見は,自然発生性の変化と考えられた.
投与終了時に観察された雌の肝臓の肉眼的な肥大,雌雄の中心性の肝細胞腫脹は肝機能に関する臨床検査値の明らかな上昇もなく,毒性変化というより生体の適応反応と考えられた.すなわち被験物質投与によって ,薬物代謝誘導などにより,肝細胞が肥大したものと考えられた5).この変化は回復試験終了時には観察されず,可逆性の変化と考えられた.
投与終了時に観察された雄の腎臓の硝子滴変性および投与終了時と回復試験終了時に観察された雄の腎臓の好酸性小体は,近位尿細管に観察された.揮発性炭化水素類の薬物投与により,肝臓で合成されたα 2u-グロブリンが揮発性炭化水素と結合し,蛋白代謝の低下した近位尿細管に蓄積するとされ,蓄積が強くなると尿細管上皮細胞の変性,壊死,再生変化,蛋白円柱が観察される6).本試験の1,2,3-トリメチルベンゼンもベンゼン環をもつ揮発性炭化水素であり,同様の所見が観察されたと考えられた.
回復試験終了時の雄の 1000 mg/kg群の1例にも同様の変化が認められたものの,発生数の減少より回復傾向はあるものと考えられた.
また投与終了時に観察された雌の脾臓の鬱血および雄の脾臓の赤血球系造血亢進,回復試験終了時に観察された雌雄の脾臓の赤血球系造血亢進と色素沈着は,投与期間および回復期間中の赤血球系の臨床検査値の異常はみられず,骨髄の異常も観察されなかったことから原因は不明であった.しかし血液凝固系の延長が起こっており,また造血障害を示唆する文献もあることから 3),投与期間中に何らかの赤血球への障害があったことが示唆され,回復期での造血亢進は障害に対する回復反応とも考えられた.
以上のことから,本被験物質は腎臓,血液凝固系を主な標的とし,無影響量は雌雄とも 100 mg/kg/day未満と判断された.従って無影響量が求まらなかったことから,さらに低用量による追加試験を実施した.
| 1) | P. Kasirzewski A. Weaderna-Brychat and B. Czerski Determination of dimethylobenzoic acid isomers in wreie by gas chromatography. Medycyna Pracy, 45(1), 37(1994). |
| 2) | P. I Mikulski and R. Wiglusz, The comparative metofolism of mesitylen;pseudocumene, and heminellitene in rats. Toxicol. Appl. Pharmocol., 31(1), 21(1995). |
| 3) | Information Profiels of Potential Occupational Hazard:Trimethyl-benzens, Govt Reports Announcements & Index (GRA & I), Issue 15, 1987. |
| 4) | G. Feuer et al. Alanine aminotransferose activity of not tissues following the administration of cefazolin. Toxical. Appl. Pharmacol., 41, 185(1977). |
| 5) | 松原尚志,戸内明,ラット血中および肝内酵素活性に及ぼすCefamandoleの影響:GTP活性低下機作の解析.Chemothorapy, 27, 740 (1979). |
| 6) | P. Greaves, "Urinary Tract, Histpathology of Preclinical Toxicity Studies," ELSEVIER, The Netherlands, 1990, pp.497-583 |
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 井上博之 | ||
| 試験担当者: | 各務 進,庄子明徳,渡 修明, 小林和雄,松木由加 | ||
| (財)食品農医薬品安全性評価センター | |||
| 〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜 582-2 | |||
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | ||
| Correspondence | |||
| Authors: | Hiroyuki Inoue(Study director), Susumu Kakamu, Akinori Shoji, Nobuaki Watari, Kazuo Kobayashi, Yuka Matuki | ||
| Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center) | |||
| 582-2 Shioshinden Aza Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan | |||
| Tel 81-538-58-1266 | Fax 81-538-58-1393 | ||
ラットは 1群雌雄各5匹で4試験群,計40匹を使用した.
1,2,3-トリメチルベンゼンは,コーン油に溶解し,0,3,10および30 mg/kgを毎日1回,4週間連続経口投与し,一般状態の観察,体重測定,摂餌量測定,血液凝固能検査,血液生化学検査(GOTおよび塩素のみ)および病理学的検査(剖検)を行った.
その結果は,次のとおりであった.
一般状態の観察では,雌雄とも投与期間を通じて異常動物は認められなかった.
体重,摂餌量および飼料効率は,雌雄とも群間で差が認められなかった.
血液凝固能検査では,活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT),プロトロンビン時間(PT)およびフィブリノーゲン量のいずれも,雌雄ともに被験物質投与群と対照群とで差が認められなかった.
血液生化学検査の結果,雌雄のすべての被験物質投与群とも GOTおよび塩素の2項目について,対照群と差が認められなかった.
病理学的検査の結果,被験物質の影響が示唆される肉眼所見は雌雄いずれの群にも認められなかった.
以上のことから,無影響量は雌雄とも 30 mg/kg/dayと判断された.
なお,動物の馴化期間を含め,投与および回復期間中,データの信頼性に影響を及ぼしたと思われる環境要因の変化はなかった.
採血するに当り,動物は約 16時間絶食させた.動物をエーテルで麻酔後開腹し,腹部大動脈から採血した.
a. 血液凝固能検査
クエン酸ソーダ添加血液の血漿について,プロトロンビン時間 (Quick 1段法),活性化部分トロンボプラスチン時間(クロット法)およびフィブリノーゲン量(トロンビン時間法)を血液凝固自動測定装置KC-40(独国Amelung社)を用いて測定した.
b. 血液生化学検査
血清を用いて,塩素 (電極法)をEKTACHEM 700N(米国コダック社)で,グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT:Karmen改良法)をCentrifiChem ENCORE��(米国ベーカー社)で測定した.
有意水準は5および1%の片側検定で実施した.
体重,摂餌量および飼料効率は,雌雄とも被験物質投与群で差が認められなかった.
血液凝固能検査については,前試験 (投与量0,100,300および1000 mg/kg)で認められたPTおよびAPTTの延長傾向が,雌雄の30 mg/kg群では認められなかった.
血液生化学的検査の結果, GOTおよび塩素は,雌雄とも対照群と被験物質投与群とで差が認められなかった.
剖検所見にも被験物質投与と関連づけられる異常は認められなかった.
以上のことから,無影響量は雌雄とも 30 mg/kg/dayと判断された.
| 連絡先 | |||
| 試験責任者: | 井上博之 | ||
| 試験担当者: | 各務 進,庄子明徳,渡 修明, 小林和雄,松木由加 | ||
| (財)食品農医薬品安全性評価センター | |||
| 〒437-12 静岡県磐田郡福田町塩新田字荒浜 582-2 | |||
| Tel 0538-58-1266 | Fax 0538-58-1393 | ||
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| Authors: | Hiroyuki Inoue(Study director), Susumu Kakamu, Akinori Shoji, Nobuaki Watari, Kazuo Kobayashi, Yuka Matuki | ||
| Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center) | |||
| 582-2 Shioshinden Aza Arahama, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-12, Japan | |||
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