4-(1-メチルエテニル)フェノールの細菌を用いる復帰変異試験

Reverse Mutation Test of 4-(1-Methylethenyl)phenol in Bacteria

要約

4-(1-メチルエテニル)フェノールについて，細菌を用いる復帰変異試験を実施した．

試験菌株として，Salmonella typhimurium(TA100，TA98，TA1535，TA1537)およびEscherichia coli(WP2 uvrA)の5菌株を用いた．用量設定試験ではS9 mix無添加群および添加群の各試験菌株において2.29～5000 μg/plateの8用量，本試験ではS9 mix無添加群および添加群ともTA100，TA1535，TA98およびTA1537において12.5～800 μg/plateの7用量，WP2 uvrAにおいて50.0～1600 μg/plateの6用量で試験を実施した．

その結果，S9 mix無添加群および添加群のいずれにおいても，溶媒対照に比べ復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．ただし，S9 mix非存在下のTA100およびWP2 uvrAにおいて，陽性対照群のコロニー数が背景値から外れたため，同用量で再試験を実施した．その結果，両菌株において復帰突然変異コロニー数の明確な増加は認められなかった．これら両試験系での試験結果は，用量設定試験，本試験および再試験において再現性が確認された．

以上の結果より，本試験条件下では4-(1-メチルエテニル)フェノールは，変異原性を有しない(陰性)と結論した．

方法

1.　試験菌株

細菌を用いる復帰変異試験に広く使用されていることから，試験菌株としてヒスチジン要求性のSalmonella typhimurium TA100，TA98，TA1535およびTA15371)ならびにトリプトファン要求性のEscherichia coli WP2 uvrA2)の5種類の菌株を選択した．

ネズミチフス菌は昭和58年9月9日にカリフォルニア大学のB. N. Ames教授から，また，大腸菌については昭和58年3月16日に国立衛生試験所(現:国立医薬品食品衛生研究所)から分与を受けた．平成12年10月27日に菌株の特性検査を実施し，本試験に用いた菌株が規定の特性を保持していることを確認した．

各菌株の菌懸濁液はジメチルスルホキシド(DMSO:MERCK KGaA)を添加した後，凍結保存用チューブに0.2 mLずつ分注した．これを液体窒素を用いて凍結し，超低温フリーザーに-80 ℃で保存した．

2.　培地の調製

1)　最少グルコース寒天平板培地(プレート)

オリエンタル酵母工業(株)製のテスメディアAN培地を購入し，試験に用いた．本プレートは，Vogel-Bonnerの最少培地Eを含む水溶液(0.02 %硫酸マグネシウム・7水塩，0.2 %クエン酸・1水塩，1 %リン酸二カリウム・無水塩，0.192 %リン酸一アンモニウム，0.066 %水酸化ナトリウム[いずれも最終濃度])に2 %のグルコース(和光純薬工業(株))と1.5 %の寒天(伊那寒天BA-30A)を加え，径90 mmのシャーレに1枚当たり30 mLを分注したものである．

2)　トップアガー(軟寒天)

塩化ナトリウム0.5 w/v%を含む0.6 w/v% Bacto-agar(Difco)水溶液10容量に対し，ネズミチフス菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-ヒスチジン(関東化学(株))-0.5 mmol/L D-ビオチン(関東化学(株))水溶液を1容量加え，大腸菌を用いる試験の場合，0.5 mmol/L L-トリプト ファン(関東化学(株))水溶液を同じく1容量加え用いた．

3.　前培養条件

内容量200 mLのバッフル付三角フラスコに2.5 w/v%ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient Broth No. 2:OXOID)溶液を25 mL分注し，これに融解した菌懸濁液を50 μL接種した．ウォーターバスシェーカー(MM-10:タイテック(株))を用い，37 ℃で8時間振盪(往復振盪:100回/分)培養し，菌濃度を確認した後試験に使用した．

4.　S9 mix

製造後6ヵ月以内のキッコーマン(株)製S9 mixを試験に使用した．S9 mix中のS9は誘導剤としてフェノバルビタールおよび5,6-ベンゾフラボンを投与したSprague-Dawley系雄ラットの肝臓から調製されたものである．S9 mixの組成を以下に示す．
成分S9 mix 1 mL中の量
S90.1 mL
MgCl28 μmol
KCl33 μmol
G-6-P5 μmol
NADPH4 μmol
NADH4 μmol
Na-リン酸緩衝液(pH 7.4)100 μmol
蒸留水残量

5.　被験物質

4-(1-メチルエテニル)フェノール(ロット号:001109)は純度99 %以上の白～淡黄色粉体である．本剤は水に難溶，アセトンおよびエタノールに可溶，DMSOに易溶であり，DMSO溶液中で安定である．三井化学(株)(東京)から提供された被験物質を使用した．被験物質は，使用時まで冷凍庫で保管した．試験終了後，被験物質提供元において残余被験物質を分析した結果，安定性に問題はなかった．

6.　被験物質液の調製

試験の都度，モレキュラーシーブを用いて脱水処理を行ったDMSO(MERCK KGaA)で被験物質を溶解して調製原液とした．調製原液を使用溶媒を用いて順次所定濃度に希釈した後，速やかに処理を行った．

7.　試験用量の設定

2.29～5000 μg/plateの8用量(公比3)を用いて用量設定試験を実施した．S9 mix無添加群および添加群の各試験菌株でいずれの用量においても復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．また，S9 mix非存在下のTA100，TA1535，TA98，TA1537およびS9 mix存在下のTA100，TA1535，TA1537では556 μg/plate以上，S9 mix非存在下および存在下のWP2 uvrAおよびS9 mix存在下のTA98では1667 μg/plate以上の用量において生育阻害作用が観察された．なお，コロニー計数時，両試験法5000 μg/plateの用量で白色粉末状の析出物が観察された．

従って，本試験においてはS9 mix無添加群および添加群のTA100，TA1535，TA98およびTA1537において800 μg/plateを最高用量とし，それぞれ7用量(公比2)を，WP2 uvrAにおいて1600 μg/plateを最高用量とし，それぞれ6用量(公比2)を設定した．

また，S9 mix非存在下のTA100およびWP2 uvrAにおいて，陽性対照群のコロニー数が背景値から外れたため，同用量で再試験を実施した．

8.　陽性対照物質

陽性対照物質として下記に示した物質を使用した．これらの陽性対照物質は，DMSOを用いて溶解し，少量ずつ分注した後凍結保存(-20 ℃)した．
AF-2:2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド(和光純薬工業(株))
NaN3:アジ化ナトリウム(和光純薬工業(株))
9-AA:9-アミノアクリジン塩酸塩(Aldrich社)
2-AA:2-アミノアントラセン(和光純薬工業(株))

9.　試験方法

Amesらの原法1)の改良法であるプレインキュベーション法に準じて，S9 mix無添加群および添加群それぞれについて試験を実施した．試験管に，使用溶媒，被験物質液あるいは陽性対照物質溶液を100 μL，次いでS9 mix無添加群の場合，0.1 mol/Lナトリウム・リン酸緩衝液(pH 7.4)を500 μL，S9 mix添加群の場合，S9 mixを500 μL添加し，さらに試験菌液100 μLを加え，37 ℃で20分間振盪培養(プレインキュベーション)した．培養終了後，あらかじめ45 ℃に保温したトップアガーを2 mL添加し，混合液をプレート上に重層した．37 ℃の条件で48時間各プレートを培養した後，被験物質の試験菌株に対する生育阻害作用を確認するため，実体顕微鏡(× 60)を用いてプレート上の試験菌株の生育状態を観察した．次いで，復帰突然変異により生じたコロニーを計数した．計測に際してはコロニーアナライザー(CA-11:システムサイエンス(株))を用いた．各濃度につき3枚のプレートを使用した．

10.　結果の解析

復帰突然変異コロニー数が溶媒対照のほぼ2倍以上に増加し，かつ，再現性あるいは被験物質の用量に依存性が認められた場合に，陽性と判定した．

なお，統計学的手法を用いた検定は実施しなかった．

結果および考察

用量設定試験の結果をTable 1～2に，本試験の結果をTable 3～4に示した．S9 mix無添加群ならびに添加群ともいずれの試験菌株においても，4-(1-メチルエテニル)フェノール処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．また，各試験菌株のいずれの処理群においても試験菌株に対する生育阻害作用が高用量群で観察された．一方，陽性対照物質はそれぞれの試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．なお，コロニー計数時，析出等の特筆すべき変化は観察されなかった．ただし，S9 mix非存在下のTA100およびWP2 uvrAにおいて，陽性対照群のコロニー数が背景値の上限から外れたため，再試験を実施した．再試験の結果をTable 5に示した．S9 mix非存在下の両試験菌株において，被験物質処理による復帰突然変異コロニー数の明確な増加傾向は認められなかった．また，両試験菌株のいずれの処理群においても試験菌株に対する生育阻害作用が高用量群で観察された．一方，陽性対照物質は両試験菌株において，溶媒対照群の2倍以上の復帰突然変異コロニーを誘発した．

以上の試験結果から，本試験条件下において，4-(1-メチルエテニル)フェノールの微生物に対する遺伝子突然変異に関し，陰性と判定した．

なお，本被験物質[4-(1-メチルエテニル)フェノール]の変異原性に関する報告はなかった．類縁体である2,4,6-trichlorophenolはV79培養細胞を用いたhprt突然変異試験で陽性との報告があった3)．しかしながら，類縁体である4-alkylphenolsの変異原性に関する報告はなかった．

文献

1)D. M. Maron and B. N. Ames, Mutat. Res., 113, 173 (1983).
2)M. H. L. Green and W. J. Muriel, Mutat. Res., 38, 3 (1976).
3)K. Jansson, V. Jansson, Mutat. Res., 280(3), 175 (1992).

連絡先
試験責任者：益森勝志
試験担当者：尾伸也，田中　仁，仲村渠奈美子，菊池正憲，赤星まゆみ
(財)食品農医薬品安全性評価センター
〒437-1213　静岡県磐田郡福田町塩新田582-2
Tel 0538-58-1266Fax 0538-58-1393

Correspondence
Authors:Shoji Masumori(Study Director)
Shin-ya Ozaki, Jin Tanaka, Namiko Nakandakari, Masanori Kikuchi, Mayumi Akahoshi
Biosafety Research Center, Foods, Drugs and Pesticides(An-pyo Center)
582-2 Shioshinden, Fukude-cho, Iwata-gun, Shizuoka, 437-1213, Japan
Tel +81-538-58-1266Fax +81-538-58-1393